上海市2株蚊源盖塔病毒的分离鉴定及分子特性分析

钟登科，李尚同，张俊杰，秦爱建

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 上海农林职业技术学院，上海 201600；3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

盖塔病毒(Getah virus，GETV) 是一种由吸血节肢动物传播的单股线状RNA病毒，属披膜病毒科(Togaviridae) 甲病毒属(Alphavirus)成员[1-2]，该病毒可以引起猪的流产、马的发热皮疹和淋巴结肿大[3-5]。此外该病毒也感染人类，一些研究表明在马来西亚、澳大利亚和中国的健康人和发热患者的血清标本中检测到GETV中和抗体[5-7]。

1955年首次在马来西亚的雪背库蚊中分离到GETV MM2021株[8]。至今已陆续在日本、澳大利亚、中国、蒙古国和俄罗斯等13个国家或地区的蚊媒和发病动物(马或猪)的组织或血液中分离到GETV[9]。我国于1964年首次在海南蚊媒中分离到GETV M1株[10]，以后陆续在中国多个省市的蚊媒和动物样品中检测并分离到多株GETV。本研究对2018年7月采集自上海市浦东新区和奉贤区马场的蚊子样品进行检测，从中华按蚊、三带喙库蚊样本中成功分离得到2株GETV，命名为SH201801、SH201802。对其E2蛋白的基因序列进行测定和分析，了解分离株的遗传变异情况，以期为上海地区GETV感染的防控提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

白蚊伊蚊卵细胞(C6/36)和金黄地鼠肾细胞(BHK-21)均由中国农业科学院上海兽医研究所传代保存。蚊媒样品是于2018年7月18:00至次日6:00采用利用紫外捕蚊灯在上海市浦东新区和奉贤区多个马场采集的蚊虫，共捕获成蚊6 864只。QIAampR Virus RNA Mini Kit购自Qiaqen公司；兔抗GETV E2蛋白多克隆抗体由中国农业科学院上海兽医研究所马志永研究员馈赠，荧光素标记羊抗兔抗体(FITC-IgG)购自Sigma公司。

1.2 引物设计与合成

参考GenBank中GETV SH05-6株(EU015066.1)的结构蛋白E2核苷酸序列，利用Primer 5.0软件设计GETV特异性引物GETV-F：5′-AAGTGCCATGCACAACGTACC-3′/GETV-R：5′-GGCGAACATGTAACATGACGCC-3′和E2基因全长引物E2-F：5′-AGTGTGACGGAACACTTCAATGTCTAC-3/E2-R：5′-GGCATGCGCTCGTGGT-3′，由上海生工合成。

1.3 样本处理与病毒分离

参考文献[10]对捕获的蚊媒进行形态鉴定和分类计数，选取雌蚊用PBS进行研磨，12 000 r/min离心8 min，无菌过滤后将滤过液分别接种于单层C6/36细胞或BHK-21细胞，依次盲传5代，并设正常细胞对照组。每天观察细胞的病变情况，当约70%细胞出现病变时收获细胞、离心后收获上清液于-80 ℃冻存。

1.4 RT-PCR鉴定

取细胞培养上清液使用QIAamp病毒基因组提取试剂盒按照操作说明书提取病毒RNA，利用SuperScriptTMⅢ AMV反转录酶进行RNA的反转录获得cDNA。以2 μL cDNA为模板，上、下游引物各0.5 μL，PCR酶Mix 10 μL，DEPC水7 μL，混匀后置于PCR仪中扩增。反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，扩增40个循环，最后72 ℃延伸5 min。用1.0%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳鉴定。选取阳性产物送至上海生工测序。

1.5 间接免疫荧光(IFA)鉴定

参考文献[3]对分离株进行IFA鉴定。

1.6 序列测定与分析

扩增产物经过胶回收纯化后，连接T载体，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选，选择白色菌落进行培养后，送检测序，序列测定后在GenBank中下载GETV参考病毒的E2基因核苷酸序列，使用MegAlign软件完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析，并绘制基于Neighbor-joining(NJ)法的系统进化树。本研究中引用的GETV毒株序列信息如下：AH9192(MG865965)、DY0824(KY434328)、DH10M1105(KY450689)、GETV-GDFS2-2018(MT086508)、GETV-V1(KY399029)、GS10-2(EU015070)、GX201808(MT269657)、GZ201808(MK487997)、GZ0881(KY457548)、GZ0862(KY457546)、HNNY-1(MG865966)、HuN1(MF741771)、JL1708(MG869691)、JL1808(MH722256)、JS18(MT210319)、LEIV 16275 Mag(EF631998)、LEIV 17741 MPR(EF631999)、M1(EU015061)、MM 2021(AF339484)、SC201807(MK693225)、SD1709(MH106780)、SH05-6(EU015066)、SH05-16(EU015068)、SC1210(LC107870)、YN0542(EU015064)、YN12031(KY434327)。

2 结果

2.1 细胞病变观察

采集自上海市浦东新区和奉贤区马场的蚊子经鉴别分类，统计如下：雄蚊664只(9.67%)、雌蚊6 200只(90.33%)，包括三带喙库蚊5 960只(96.13%)、中华按蚊188只(3.03%)、其他蚊种52只(0.84%)。选取雌蚊，每100只蚊子研磨成一个样品。

经过连续5次盲传，所有样品在C6/36细胞上没有出现细胞病变，仅从其中的中华按蚊、三带喙库蚊2个阳性样品在BHK-21细胞第4次传代后出现细胞病变。与正常的BHK-21细胞相比较，接种阳性培养物的细胞在感染72 h左右开始出现细胞间隙增大、皱缩、变圆，并大面积脱落，第6天细胞完全脱落。

2.2 RT-PCR鉴定

提取2个病变的细胞上清总RNA反转录成cDNA，以特异性引物GETV-F/GETV-R和E2基因全长引物E2-F/E2-R对2个阳性培养物进行鉴定并扩增GETV的E2基因，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，2个阳性培养物均出现了约718 bp和1 200 bp的条带，与预期相符合(图1)，初步证实2个阳性培养物为GETV阳性，命名为SH201801、SH201802。

1～2. 全长E2基因；4～5. E2基因特异片段；M. DNA标准DL2000; 3，6. 阴性对照

2.3 IFA鉴定

与未接毒细胞相比，感染GETV分离株SH201801和SH201802的细胞均出现特异性的绿色荧光，主要集中在胞浆中(图2)，可进一步鉴定SH201801株、SH201802株为GETV。

A. SH201801株感染的BHK-21细胞; B. SH201802株感染的BHK-21细胞;C. 未感染的BHK-21细胞

2.4 序列分析

E2蛋白是GETV诱导中和抗体产生的主要结构蛋白[11]。采用DNAStar软件将浦东新区和奉贤区多个马场采集的蚊虫分离的GETV SH201801株和SH201802株的E2基因与从GenBank中选择的33株GETV的E2基因进行序列比对，结果显示，SH201801株和SH201802株间核苷酸同源性为99.3%氨基酸同源性为100.0%。SH201801株与上海库蚊源分离株SH05-16的核苷酸同源性最高，为99.8%，氨基酸同源性为100.0%；与马来西亚原始株MM2021的核苷酸同源性最低，为93.6%，氨基酸同源性为96.9%。SH201802株与上海库蚊源分离株SH05-6的核苷酸同源性最高，为99.9%，氨基酸同源性为100.0%；与马来西亚原始株MM2021的核苷酸同源性最低，为94.2%，氨基酸同源性为96.9%。GETV的E2基因有1 266个核苷酸编码422个氨基酸的病毒包膜糖蛋白。GETV SH201801株和SH201802株与马来西亚原始株MM2021有12个氨基酸差异位点，与国内首个分离株M1有5个氨基酸差异位点(表1)。

表1 GETV分离株E2蛋白氨基酸序列位点与参考毒株的差异

以E2基因为基础绘制系统发育树(图3)，其中包括涵盖1955—2018年的病毒分离株(中国23株，俄罗斯、蒙古和马来西亚各1株)，毒株分离年代，宿主包括蚊、猪和马。28株病毒被分成3大分支，GETV SH201801株和SH201802株分别与以往的上海分离株SH05-16、SH05-6位于同一进化分支，亲缘关系最近，与进化分支的根部马来西亚原始株MM2021的亲缘性较远。SH201801株和SH201802株属于Group Ⅲ GETV。

•本研究分离毒株

3 讨论

自1955年在马来西亚首次从库蚊中分离出GETV以来，先后在日本、澳大利亚、中国和韩国等13个国家或地区从多种蚊虫和马匹以及猪样品分离到约50株GETV。目前已经发现GETV可以引起马匹和猪的疾病，感染马匹后可引起短暂的发热、皮疹和腿部水肿[4]，感染猪只后可引起发热、厌食症、抑郁和腹泻，并可导致胎儿死亡和生殖障碍[3]。已有研究发现该病毒也可以感染人类[6-7]。

蚊类是GETV的重要传播媒介。上海属于亚热带季风气候，蚊种多样性丰富，适宜温湿度给蚊虫孳生创造了条件。同时上海作为我国重要的商贸口岸城市，国际交流频繁，为蚊媒病毒的传播提供了机会。目前已经在4属9种蚊虫(三带喙库蚊、中华按蚊、伪杂鳞库蚊、环带库蚊、棕头库蚊、刺扰伊蚊、白纹伊蚊、雪背库蚊和阿蚊)中分离到GETV[9-10,12-13]。本研究从上海市浦东新区和奉贤区马场采集的中华按蚊、三带喙库蚊样本中成功分离得到2株GETV，丰富了上海地区的GETV传播媒介。

GETV E2基因编码病毒囊膜蛋白，是病毒与宿主细胞受体互作的重要膜蛋白，也是主要的抗原蛋白[11]。E2基因全长均为1 266 bp，编码422 aa[2]。本研究的分离株SH201801和SH201802与上海以往的库蚊源分离株SH05-16、SH05-6的氨基酸序列没有差异，但与马来西亚原始株MM2021有12个氨基酸差异位点，与国内首个分离株M1有5个氨基酸差异位点(表1)。根据E2基因进行遗传演化分析，可将GETV分为3个不同的群，本研究的分离株SH201801和SH201802与我国大多数毒株亲缘关系较近，均属于GroupⅢ[14]，表明国内GETV 分离株E2基因较为保守；但与马来西亚原始株MM2021和俄罗斯伊蚊分离株LEIV 16 275的亲缘关系较远，表明GETV经过50多年的进化，出现了一定的变异[14]。

综上，本研究从上海市浦东新区和奉贤区马场采集的中华按蚊、三带喙库蚊样本中成功分离得到2株GETV，丰富了上海市GETV的传播媒介，有利于了解上海市马场蚊源GETV的分子生物学特征。目前关于GETV致病机制尚未清楚，因此深入开展GETV感染的流行病学和致病机制的研究具有十分重要的公共卫生意义。