壬基酚对小鼠肝肾组织的多毒性效应研究

杨少青，周彬，邵春艳，宋泉江，宋厚辉*，王晓杜*，姜胜*

(1. 浙江农林大学动物科技学院动物医学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300；3. 动物健康互联网检查技术浙江省工程实验室，浙江 杭州 311300)

壬基酚(nonylphenol，NP)是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)的主要降解产物和中间体，广泛存在于土壤、空气和水中[1-2]。壬基酚具有一定的雌激素活性，属环境内分泌干扰物(EEDs)[3]，能够通过水体、土壤和空气进入动物体内，并通过食物链富集放大，严重影响动物和人类健康及水生生态系统安全[4]。研究发现NP对动物和人类具有多器官毒性作用[5-9]，而且在人尿样和脂肪组织中检测到NP[10-11]。最近的研究表明，接触EEDs会增加代谢紊乱的风险，如脂肪变性、肥胖和II型糖尿病等[12-15]。目前，NP对人类及动物健康的影响已不容忽视。因此，本研究探讨了NP染毒对小鼠肝肾损伤效应，为研究NP促发脂肪肝性疾病和肾脏疾病作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

壬基酚(NP，纯度≥99%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米油购自北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 实验动物分组与处理

清洁级ICR小鼠(40只，雌雄各半，体重18～23 g)购自杭州子源实验动物科技有限公司，实验动物合格证号为20201225Abzz0105999790。小鼠饲养于温控净化实验动物房中，环境温度保持24～26 ℃，饲喂商品化颗粒饲料和清洁饮水。饲喂1周后，小鼠随机分为4组，分别为对照组(CON)和低(LNP)、中(MNP)、高剂量(HNP)NP染毒组，每组10只，雌雄各半。试验期间每天于上午9：00，采用口服灌胃法进行染毒试验，CON小鼠给予玉米油，LNP小鼠给予100 mg/kg NP，MNP小鼠给予150 mg/kg NP，HNP小鼠给予200 mg/kg NP。各组灌胃体积为0.01 mL/kg，每晚21:00禁食，连续灌胃30 d，每天1次。每日观察小鼠精神状态、饮水与采食情况、排便排尿情况等。每5 d测量小鼠的体重变化并调整灌胃量。

1.3 体重日均增重量及肝肾脏器系数测定

染毒30 d结束后，小鼠称重计算体重日均增重率，日均增重率=(试验后体重-试验前体重)/试验天数。称重结束后小鼠处死，迅速分离肝脏和肾脏进行称重，并计算肝或肾脏器系数(肝或肾脏器系数=肝或肾重量/体重×100%)；取部分肝肾组织用于病理形态学分析，其余组织-80 ℃保存备用。

1.4 小鼠肝脏和肾脏组织病理学观察

每组取适量肝脏和肾脏组织至于10%甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，制备切片，HE染色后光学显微镜下观察肝脏和肾脏显微结构变化。

1.5 小鼠肝功和肾功参数的测定

小鼠处死前，经颌下静脉采血0.5 mL，室温静置10 min后3 500 r/min离心10 min，取适量血清，使用动物专用生化分析仪检测肝功和肾功参数：谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、血尿素(UREA)和血清磷(P)。

1.6 统计学方法

试验所得数据表示为“平均值±标准差”，使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据制图，试验数据采用单因素方差分析，运用t检验进行数据配对差异分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 体重日均增长量及脏器系数

试验过程中，各组试验小鼠均未出现死亡，对照组小鼠精神状态良好，采食量和饮水量均正常；低剂量NP染毒小鼠精神状态未见明显异常，但采食量和排便量均稍减少，中高剂量NP染毒小鼠精神状态尚可，被毛稍显粗乱，欠光泽，采食量和排便量下降，各组小鼠活动能力未见明显异常。经过30 d染毒，各组染毒小鼠的日均增重量随着NP剂量的增加而降低，且均显著低于对照组(P<0.01)；与CON比较，LNP、MNP和HNP小鼠的肝体系数显著升高(P<0.05)；CON相比，各染毒组小鼠肾体系数无显著性变化(P>0.05)。总体而言，随着NP染毒剂量增加，小鼠增重量逐渐降低，增重量与NP染毒剂量呈负相关，说明NP染毒可影响小鼠的生长发育。各组小鼠体重日均增长量和脏器系数见图1。

*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。下同

2.2 肝脏和肾脏组织病理学检测

如图2所示，LNP小鼠肝脏中央静脉周围可见少量肝细胞水肿，胞质疏松淡染(黑色箭头)，少量肝细胞轻度脂肪变性，胞质中可见较小的圆形空泡(黄色箭头)；MNP小鼠肝细胞水肿，胞质疏松淡染(黑色箭头)；局部汇管区门静脉周围可见少量淋巴细胞浸润(黄色箭头)；HNP小鼠肝脏中央静脉周围可见大量肝细胞水肿，胞质疏松淡染(黑色箭头)；肝细胞脂肪变性，胞质中可见较小的圆形空泡(黄色箭头)。如图3所示，LNP小鼠肾脏局部肾小囊腔内有少量嗜酸性物质(黑色箭头)；MNP小鼠肾脏肾小管扩张(黑色箭头)；局部可见肾小管上皮细胞轻度水肿(黄色箭头)；HNP小鼠肾脏有大量肾小囊腔萎缩(黑色箭头)。

A. CON组；B. LNP组；C. MNP组；D. HNP组

A. CON组；B. LNP组；C. MNP组；D. HNP组

2.3 肝功和肾功参数检测

小鼠经过不同剂量NP灌胃后血清肝功和肾功参数的变化见图4和图5。与CON比较，LNP、MNP和HNP小鼠血清AST和ALP含量均显著升高(P<0.05)，HNP小鼠血清ALT和TP含量显著升高(P<0.01)，HNP小鼠血清ALB含量显著降低(P<0.01)；与LNP比较，HNP小鼠血清AST、ALT和TP含量均显著升高(P<0.05)；与MNP比较，HNP小鼠血清ALT和TP含量均显著升高(P<0.05)。各组小鼠血清中TBIL含量均无显著性变化(P>0.05)。与CON比较，MNP和HNP小鼠血清UREA和血清P含量均显著升高(P<0.05)，LNP小鼠血清P含量显著升高(P<0.05)，LNP、MNP和HNP小鼠血清CREA含量无显著性变化(P>0.05)；与LNP比较，MNP和HNP小鼠血清P含量均显著升高(P<0.01)；与MNP比较，HNP小鼠血清P含量显著升高(P<0.01)。

图4 不同剂量NP对小鼠血清肝功参数的影响

图5 不同剂量NP对小鼠血清肾功参数的影响

3 讨论

NP是一种典型的内分泌干扰物，在环境中检出率较高，而且在卵巢、肝脏、肾脏等器官及血清中容易蓄积[16]。研究表明NP能够与雌激素受体结合，破坏组织器官氧化应激平衡状态[17]，从而破坏机体内分泌状态及代谢器官(如肝脏)的生理功能[18]。本研究中经不同剂量NP灌胃30 d后，小鼠体重增长量随着NP剂量的增加而降低，说明NP染毒抑制小鼠体重增长，这与大鼠的研究结果保持一致[19]。脏体系数是一种反映毒物对动物机体脏器毒害作用的综合性参数，可反映该脏器长期受影响的情况，是亚慢性毒性试验中较为常用的评价指标。组织脏体系数增加，预示该脏器可能出现增生、肥大、水肿或充血；组织脏体系数下降，预示染毒后该脏器出现了萎缩或其他退行性病变[20]。因此，脏体系数变化可提示脏器组织形态病理学的变化[21]。本研究中NP染小鼠肝脏脏体系数增加，肾脏脏体系数降低，这也与已有研究结果保持一致[21]，说明肝脏和肾脏是NP毒性效应器官之一。综合小鼠体重增长量和脏体系数的变化，说明NP染毒可影响小鼠的生长发育。

肝脏是机体主要的解毒和代谢器官，参与机体的解毒、代谢、排泄等多种生理功能。AST和ALT是最为常见的表征肝功能的生物标志物[22-24]。AST通常仅存在于肝脏，而ALT也见于骨骼肌、肾脏、大脑和红细胞中。正常情况下，血中ALT和AST水平较低，但肝细胞受到损害或肝细胞膜通透性增加后，ALT和AST会由细胞中渗出，转入血液循环[25]。肝功能异常不仅表现在血清中AST、ALT升高，血中ALB降低也能说明肝功能异常[26]。当肝脏受损时，经由肝细胞合成的ALB合成量减少，因此血清中ALB水平降低显示肝细胞合成功能降低。本研究中肝脏损伤标志物AST与NP剂量呈正相关，小鼠血清AST水平随着NP剂量的增加而增加。血清中ALT和ALB水平变化虽与NP剂量未呈现正相关关系，但高剂量NP染毒小鼠ALT高于对照组，而ALB则低于对照组。因此本研究结果表明，NP染毒30 d对小鼠肝脏造成一定损伤。另外肝脏组织病理学分析结果也可印证，各组NP染毒小鼠肝脏组织均出现水肿和脂肪变性，而且发生水肿的肝细胞数量随着NP染毒剂量的增加而增加，表明NP进入小鼠体内后，在肝脏中蓄积，导致肝细胞发生水肿，进一步提示肝损伤的发生，这也与小鼠肝脏脏体系数结果相呼应。这可能跟NP具有亲脂性，容易在肝脏组织中蓄积有关[16]。研究表明，NP可破坏小鼠肝脏结构的完整性、促进肝细胞ALT和AST的释放，抑制肝细胞合成功能，导致肝损伤。

肾脏的基本功能是生成尿液，它是机体清除体内代谢产物及某些废物、毒物的重要器官。本研究结果显示，不同剂量NP染毒30 d小鼠肾脏脏体系数并未发生明显改变，无显著性差异，表明NP暴露可能并未对肾脏造成显著的形态学损伤。血中尿素和肌酐含量是指示肾功能的标志物，血中二者水平的升高提示肾功能障碍[27]。有研究发现NP具有一定的肾毒性，会导致血中与肾功能有关的指示物(如尿酸、肌酐和葡萄糖等)发生紊乱[28]。本研究结果也证实，NP染毒后，小鼠血中尿素水平显著提高，而肌酐未发生显著性变化，提示NP可能引起小鼠肾功能损伤，使得肾脏排泄尿素的能力下降。通过HE染色对肾脏组织病理学分析发现，肾脏肾小囊腔内有少量嗜酸性物质和肾小管上皮细胞轻度水肿，高剂量NP导致小鼠肾脏肾小囊腔萎缩，说明NP对小鼠肾脏组织结构造成一定损伤。这与NP暴露3周对鱼肾脏组织结构的影响结果保持一致[29]。

综上所述，NP暴露对小鼠具有肝肾多毒性效应，可引起小鼠肝脏和肾脏发生不同程度的损伤，影响肝肾功能和组织结构。但鉴于暴露方式、暴露剂量、机体代谢及环境分布等多因素变量影响，NP对肝肾毒性的具体作用机制尚未阐明，因此NP肝肾毒性机制仍需进一步研究。