牛源无乳链球菌分离及其诱导的乳房炎小鼠模型构建

刘旭明，尚天甜，彭淑珍，鲁强生，曾巧英*，彭婕*

(1. 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2. 兰州市兽医中心，甘肃 兰州 730030)

由传染性病原体引起的乳房炎被认为是奶牛的一种破坏性疾病，表现为乳汁发生理化性质及细胞学特性的改变，以及乳腺组织发生病理学变化，最终降低奶牛生产性能，给奶业造成巨大的经济损失[1-2]。无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)为兰氏分群B群链球菌(group B streptococcus，GBS)，是引起奶牛乳房炎的主要病原之一，也是一种能够引起人和其他动物发生严重感染的病原菌[3]。近些年，构建乳房炎模型成为研究相关致病机制的一个重要方向，若直接使用奶牛作为试验动物，其成本较高，管控较复杂，因此，用小鼠构建乳房炎模型愈来愈成为研究热点[4]。相对于奶牛，小鼠具有体积小、易操控、成本低等特点。本研究旨在分离并鉴定致病性无乳链球菌并构建小鼠乳房炎模型，为进一步研究该菌致乳房炎的相关致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆明系孕鼠购买于中国农业科学院兰州兽医研究所。无乳链球菌参考株ATCC 13813、药敏试验质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923由本实验室保存。无菌脱纤维绵羊血、琼脂粉末购自北京索莱宝科技有限公司，PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司，AceQ®qPCR SYBR Green Master mix、2×TaqPlusMasterMix(Dye Plus)购自诺唯赞生物科技股份有限公司，胰酪大豆胨粉末(TSB)购自BD公司。药敏试纸及生化反应管均购自杭州滨和微生物试剂有限公司，TRIzol®Reagent购自Ambion公司，分析纯甲醛溶液、分析纯无水乙醇溶液购自天津市百世化工有限公司。

1.2 无乳链球菌分离鉴定

1.2.1 奶样采集

观察奶牛健康状况、乳房情况，同时与厂区奶工沟通，采集患有乳房炎的奶牛乳汁。分别对奶牛乳房4个乳区进行消毒，弃去前3把牛乳，用无菌试管接取5～10 mL乳汁，并做好标记。

1.2.2 细菌的分离鉴定

取奶样20 μL涂布于含5%绵羊血TSB琼脂平板，37 ℃倒置培养24 h，观察菌落形态，挑取不同形态菌落划线于TSB琼脂平板，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落经革兰染色后镜检。镜检纯一的菌落接种于TSB液体培养基，220 r/min培养过夜，4 ℃保存。

1.2.3 生化鉴定

对分离菌株进行40%胆汁、七叶苷、MR试验、VP试验、硝酸盐还原试验、蕈糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇等15种生化试验，根据细菌微量生化反应管说明书，将已纯化的菌落接种于生化反应管，37 ℃培养24 h，观察结果并记录。CAMP试验：在5% TSB血琼脂平板两侧以金黄色葡萄球菌作一横线接种，垂直处用被检菌接种1条线，两线不能相交，同时做一阴性对照。

触酶试验：取一干净载玻片，加1滴3% H2O2于载玻片中央，用接种环挑一单菌置于3% H2O2，观察有无气泡产生。

1.2.4 细菌16S rDNA PCR扩增鉴定

挑取已纯化单菌落于TSB液体培养基，37 ℃ 220 r/min培养过夜，取50 μL细菌液体培养物煮沸后，以此为模板，利用引物对UNI-16s-seqF：CVACGATVCVTAGCYGRYCTG，UNI-16s-seqR：ACGGYTACCTTGTTACGACT进行PCR扩增，PCR条件为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30个循环；72 ℃终末延伸5 min。取4 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带大小为1 237 bp，将PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序。测序结果提交NCBI中BLAST软件比对，确定细菌种属。

1.2.5 药敏检测

参照 Kirby-Baueer 氏法，将分离纯化得到的菌株进行药敏试验，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为质控菌株，取20 μL细菌液体培养物涂布于TSB琼脂，静置5 min，用镊子取药敏纸片贴于平板，轻压使其固定，37 ℃倒置培养16 h，测量抑菌圈直径，做好相应数据记录。判定标准：抑菌环直径≥20 mm为高度敏感，15 mm ≤抑菌环直径<20 mm为中度敏感， 抑菌环直径<15 mm为耐药[5]。具体药敏试纸种类及浓度见表1。

表1 药敏试纸种类及浓度

1.3 乳房炎模型的构建

1.3.1 人工感染

将产后7～10 d小鼠随机分为空白组，阴性对照组， HZ-032感染组和ATCC13813感染组，每组3只。攻毒前1～2 h隔开母鼠与仔鼠，使得母鼠乳房充盈，母鼠麻醉后经乳腺管于第四对乳腺分别注射104CFU菌悬液；阴性对照组注射相同体积的无菌PBS；空白组不做处理。

1.3.2 病料采集与处理

攻毒48 h后将小鼠经安乐法处死，剥离乳腺组织，一侧固定于10%中性甲醛，送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行HE染色组织切片制备，另一侧分别保存于无菌PBS和TRIzol试剂，用于检测乳腺组织内细菌载量及炎性因子表达量。

1.3.3 乳腺组织中载菌量测定

称取0.1 g乳腺组织，加入0.9 mL无菌PBS，组织匀浆后梯度稀释，每个梯度各吸取100 μL悬液涂布于TSB琼脂平板，37 ℃倒置培养过夜，菌落计数计算乳腺组织中细菌载量。

1.3.4 荧光定量PCR检测炎性因子

根据NCBI公布的参考序列，利用软件Primer 5.0设计荧光定量PCR引物，引物序列见表2。用TRIzol法提取乳腺组织RNA[6]，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒对提取的RNA进行反转录获得cDNA。使用AceQ®qPCR SYBR®Green Master mix(High ROX Premixed)荧光定量PCR试剂盒，采用两步法进行荧光定量PCR检测乳腺组织中炎性因子IL-1α、IL-10、IL-6及TNF-α的表达量，结果用2-ΔΔCt值表示。

表2 荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 菌落特征及染色特性

乳样划线接种于含5%绵羊血的TSB琼脂平板，37 ℃培养24 h，培养基表面可见乳白色，圆形光滑菌落，β溶血(图1)。革兰染色镜检可观察到以短、长链排列的革兰阳性球菌(图2)。将分离菌株命名为HZ-032。

图1 HZ-032在血平板上生长的菌落特征

图2 HZ-032染色镜检(革兰染色，1 000×)

2.2 生化试验

挑取纯化后的单菌落接种于生化反应管，37 ℃，24 h后根据说明书判定菌株生化特性。由表3可以看出，HZ-032菌株40%胆汁、MR、蕈糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、马尿酸盐、触酶试验呈阳性，七叶苷、VP、棉子糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸盐还原试验为阴性；ATCC13813菌株40%胆汁、MR、触酶试验、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、马尿酸盐试验呈阳性，七叶苷、VP、蕈糖、棉子糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、硝酸盐还原试验为阴性。CAMP试验可见HZ-032(图3)、ATCC 13813(图4)在与金黄色葡萄球菌交界处出现明显的矢状溶血。综上生化鉴定结果，HZ-032符合链球菌特征性生化反应，疑似无乳链球菌。

A，B. 金黄色葡萄球菌；C. HZ-032；D. 阴性对照

A，B. 金黄色葡萄球菌；C. ATCC 13813；D. 阴性对照

表3 生化试验

2.3 细菌16S rDNA PCR检测

使用16S rDNA通用引物对分离菌株基因组进行PCR扩增，有条带的 PCR产物送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果提交NCBI数据库进行比对，结果显示分离菌株为无乳链球菌。根据测序结果，利用MegAlign软件绘制分离株HZ-032亲源关系图。由图5可见，菌株HZ-032与无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(GenBank登录号：NZ_LR134512)处于同一分支。

•本研究分离菌株

2.4 药敏检测

选取林可霉素、四环素、庆大霉素、万古霉素等10种抗生素，采用纸片扩散法进行药敏试验，结果(表4)显示，质控菌株ATCC25923仅对庆大霉素及万古霉素表现中度敏感，其余均表现高度敏感；HZ-032仅对庆大霉素表现出中度敏感，而对其余9种抗生素均表现高度敏感；参考株ATCC13813对庆大霉素及万古霉素表现中度敏感，其余均表现高度敏感。

表4 药敏试验 mm

2.5 小鼠感染后临床症状

小鼠经乳头感染，空白组和阴性对照组小鼠精神活跃，被毛光滑，采食、饮水较频繁；HZ-032和ATCC13813处理组小鼠表现反应迟钝，被毛凌乱，采食、饮水次数减少，乳头周围未表现出明显症状。

2.6 小鼠乳腺组织细菌载量测定

称取0.1 g乳腺组织匀浆后倍比稀释，涂布于TSB琼脂平板，37 ℃培养过夜，对乳腺组织内细菌含量进行计数，计算1g乳腺组织载菌量，使用软件GraphPad Prism8绘制柱状图并进行显著性分析。结果显示，空白组和阴性对照组未检测到细菌，而HZ-032和ATCC13813处理组细菌载量达1010CFU/g左右(图6)。

注：****表示P<0.000 1。下同

2.7 病理变化及组织切片观察

剖检小鼠过程中可观察到空白组、阴性对照组乳腺组织均呈乳白色，并伴有大量乳汁，未观察到病理变化；处理组乳腺组织呈暗黄色，出血，乳汁减少(图7)。组织切片结果显示，空白组、阴性对照组乳腺组织结构完整，腺泡界限清晰，腺泡内含有乳汁；处理组乳腺腺泡无明显边界，充满大量中性粒细胞，腺泡上皮出现脱落、坏死(图8)。

1，2．乳汁；3，4．出血

1，2．乳汁；3，5．中性粒细胞；4．腺泡上皮脱落、坏死

2.8 小鼠乳腺组织炎症因子表达量检测

TRIzol法提取不同处理组小鼠乳腺组织RNA，反转录获得cDNA，通过荧光定量PCR检测乳腺组织中IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α等4种炎性因子的表达量。使用软件GraphPad Prism8绘制柱状图并进行显著性分析。结果表明，HZ-032和ATCC13813感染组IL-1α、IL-10、TNF-α表达量较阴性对照组及空白组均显著升高，HZ-032感染组IL-6水平明显高于其他各组(图9)。

注：*表示P<0.05，***表示P<0.001，ns表示P>0.05

3 讨论

奶牛乳房炎的发展可分为病原体入侵机体、感染和产生炎性反应3个阶段，当乳头接触到来自受感染乳腺牛奶中的细菌时，这些病原菌会以传染性的方式在奶牛中传播[7]。尽管许多细菌被认为能够引起乳房炎，但无乳链球菌和金黄色葡萄球菌被认为是最重要的传染性病原体[8]。本研究从乳房炎发病牛奶样中分离获得1株链球菌，经16S rDNA测序鉴定为无乳链球菌。小鼠乳腺结构与奶牛乳腺结构类似，较易控制，成本较低，因此成为研究乳房炎模型的最佳实验动物[9]。将分离株HZ-032经乳腺管注射至哺乳期小鼠乳腺内，可引起小鼠乳腺组织呈暗黄色、充血出血和乳汁减少。感染后小鼠乳腺组织切片较正常组可明显观察到乳腺上皮细胞溶解，腺泡内有大量中性粒细胞浸润，以上病理变化与伦艳霞等[10]构建无乳链球菌性乳房炎BALB/c小鼠模型的病理变化一致。HZ-032菌株感染48 h内可从乳腺组织中分离到大量细菌，表明该菌可造成局部感染，并在乳腺组织中繁殖。该结果与Trigo等[11]的研究结果一致。Bannerman等[12]研究表明，无乳链球菌感染后可在乳腺中诱发促炎性细胞因子，并且其组织学改变类似于在患有无乳链球菌乳房炎的母牛乳腺组织病变。而本研究中无乳链球菌分离株HZ-032诱发小鼠乳腺炎过程与之前文献中描述的牛无乳链球菌乳房炎非常相似。先天免疫反应在感染的早期阶段占主导地位，并受促炎性细胞因子的调节，促发中性粒细胞募集到感染的乳腺。当巨噬细胞识别细菌时，它们会释放促炎性细胞因子，例如IL-1、IL-10和TNF-α等，这对于有效抵抗原发感染至关重要[10,12]。IL-6是一种引起炎症的主要细胞因子，能够促进肝脏合成急性期蛋白，诱导炎症反应[13]。本研究发现，HZ-032感染小鼠后能够显著引起乳腺组织中IL-1α、IL-10、IL-6和TNF-α升高，表明HZ-032感染能够引起小鼠乳腺组织中强烈的炎症反应[14]。

4 结论

本研究从患病奶牛乳样中分离1株致病性无乳链球菌，并成功构建小鼠乳房炎模型，对于研究无乳链球菌致乳房炎的相关致病机制有重要意义，同时也为进一步寻找有效的抗菌药物奠定基础。