泛素-蛋白酶体系统对精子获能的作用

张雨阳，金一

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

精子获能会引起钙离子和碳酸氢根离子流入、增加细胞内pH值和胆固醇流出。酸碱度变化激活可溶性精子腺苷酸环化酶，增加细胞内环磷酸腺苷，从而激活蛋白激酶A(PKA)。最近的研究表明PKA使26S蛋白酶体磷酸化，并增加其糜蛋白酶样蛋白水解活性[1]。蛋白酶体一旦被PKA激活，可以通过一个反馈环直接或间接调节底物蛋白丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化。获能时的胆固醇流出会导致精子质膜流动性增加，蛋白质重新分布和形成与透明带结合的多蛋白复合物[2]。这些多蛋白复合物中鉴定出来蛋白质酶体亚单位和泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)的其他成分，表明UPS可能参与获能过程中多复合物相关蛋白的翻译后修饰。

本文综述了UPS的主要组成及在精子获能过程中的作用。

1 UPS概述

蛋白质是通过共价连接到泛素蛋白的细胞调节机制称为泛素化。泛素化是通过小分子伴侣蛋白泛素的共价连接，对靶蛋白进行的稳定、可逆的翻译后修饰。26S蛋白酶体复合体识别附着在蛋白质上的泛素链的能力可以解释细胞蛋白质是如何通过泛素化来降解的。蛋白质的泛素化通过依次激活3种酶来实现[3]，见图1。泛素化级联反应中的第一个酶是泛素激活酶E1(UBA1)。它的任务是与单个泛素分子形成瞬态硫醇酯键，该反应称为泛素活化。活跃的UBA1对猪的成功受精至关重要。被特定的UBA1抑制剂阻断会导致无法正确受精猪卵母细胞[4]。在从UBA1酶分离分子后，泛素结合酶E2与活化的泛素分子建立了瞬时的硫醇酯键。该复合物被泛素化级联反应中的第3个必需酶，即E3型泛素连接酶识别，该酶与底物蛋白结合。结合后，E3酶与E2酶相互作用，以使附着E2的泛素分子转移到靶蛋白上。泛素分子通过催化泛素的C末端和底物的内部赖氨酸残基之间的共价结合而与底物蛋白连接。因此，E3型连接酶是泛素化的底物特异性元件，并负责确定哪些蛋白质将被降解。泛素分子通过E3酶与底物结合的单泛素相连，有时还受到链延长因子(E4酶)的辅助。多泛素链由泛素与底物串联而成，由26S蛋白酶体识别，26S蛋白酶体是一种多催化蛋白酶，能将泛素化的蛋白降解为小肽。典型26S蛋白酶体由一个空心的20S核心组成，在两端或一端有一个19S调控颗粒。19S颗粒能识别、结合和移除连接到蛋白酶体降解蛋白上的多泛素链。底物蛋白经过展开并转运到20S核心，蛋白酶体降解成小肽，然后从20S核心释放出来。多泛素链被分解成重新进入泛素循环的单分子[5]。

图1 泛素-蛋白酶体系统通路

在精子获能过程中，UPS调节一些精子表面蛋白和精子血浆蛋白，26S蛋白酶体的一些亚基被翻译后修饰[6]。研究表明，UPS调节精子获能诱导的精子中锌离子外流[7]和精浆蛋白如SPINK2和DQH[8]从精子表面的脱落。有报道关于绿色荧光蛋白酶体的转基因GFP-PSMA1公猪的研究确定了在获能过程中通过UPS进行翻译后修饰的可能目标，例如MFGE-8、ADAM5、AWN1、ACRBP和SPINK2。然而，没有关于这些蛋白在获能过程中如何被UPS调节的研究。哺乳动物精子获能过程中一些UPS的靶点和底物已被确定[9]，但仍然缺乏精子获能过程中UPS靶点的复杂蛋白质组学研究。这些靶蛋白的研究将有助于全面理解精子获能过程中UPS的参与，也将揭示导致顶体细胞外分泌和过度活化的下游事件。

2 泛素化酶

2.1 激活酶(E1)

E1是UPS的起始步骤[10]。目前已发现2种E1酶，UBE1/UBA1和UBA6/UBE1L2。UBA1是负责大多数泛素介导过程的E1酶。UBA6介导的泛素激活目前仅限于特定的蛋白泛素化，因为已知的E2酶中只有一种特定的E2酶可与UBA6偶联。E1是必须激活泛素并将其有效转移至E2活性位点的多域酶。该功能对于细胞动态平衡至关重要，因为如特异性抑制细胞中E1，信号传导的破坏导致几乎整个UPS停机[11]。

最近研究表明，在小鼠、大鼠、野猪和人[12]的精子中，磷酸化蛋白质组学研究已经确定了获能过程中E1和多个蛋白酶体亚基发生磷酸化[13]。UBA1的活性对于精子获能是必需的。有研究发现UBA1的抑制防止获能诱导的精子黏附素AQN1和顶体酶抑制剂的丢失，影响精子顶体外膜的重塑，降低精子使卵母细胞体外受精的能力[4]。UBA1可能是通过影响精子-卵子融合后的精子增大和精子减数分裂染色体的分离来降低精子的受精能力[14]。与精子-ZP互作有关的一些问题可通过在精子获能过程中抑制E1酶来解决。

2.2 连接酶(E2)

E2酶是泛素化的关键转移位点，它分别与E1和E3相互作用。关于UPS，存在一个令人费解的问题是为什么不是将泛素直接从E1转移到E3。一些研究人员认为，E2酶可以与识别并选择不同靶点的不同类型的E3结合，从而在确定标记的蛋白质是否会降解或参与非蛋白水解过程中起决定性作用。换句话说，E3主要选择底物，而E2决定底物的命运。所有E2都有1个约150个残基的Ub共轭(UBC)结构域。该结构域包含泛素连接的催化半胱氨酸，以及与E1和E3蛋白相互作用所需的结合域。根据先前对来自不同E2的UBC域的结构分析，它们彼此非常相似[15]。因此，1个E2可以与多个E3s相互作用。目前的UPS研究中关于E2酶识别多种E3和特定底物的驱动机制的发现非常有限。E2酶是否可能具有独立于泛素-蛋白酶体系统的其他生物学功能仍未可知。

研究表明，E2参与精子的发生，获能和受精过程。E2酶UBCs是一个特别参与精子发生的大家族。例如，UBC4、UBC4-1和UBC4-2在精子不同部位表达，说明它们在精子发生过程中可能发挥不同的作用。有研究发现哺乳动物E2酶Ubc9与HsRad51重组酶相互作用，表明Ubc9可能在精子发生过程中的减数分裂中起调节作用[16]。E2酶HR6B及其同源物HR6A在睾丸中高度表达，HR6B同源基因的失活会导致小鼠不育。但HR6A缺陷小鼠是可育的[17]。在海鞘睾丸中检测到UBC4的同源物，并通过免疫细胞化学在精子头部和尾部观察到，这可能意味着它参与精子发生和精子获能。

2.3 结合酶(E3)

泛素结合酶(E3)可以催化泛素从E2酶转移至底物，从而调节真核生物中的多种信号转导途径。整个泛素蛋白酶体系统的特异性和效率很大程度上取决于识别特定底物的E3酶[18]。泛素分子的数量以及与靶蛋白相连的泛素的特定氨基酸残基决定了泛素化对靶蛋白的影响。最常见的结合靶蛋白形成蛋白链的连接方法是利用赖氨酸48(K48)和赖氨酸63(K63)连接。UPS容易消除K48多聚泛素化的底物[19]，而K63多聚泛素化或单泛素化的底物则通过自噬消除[20]。表明可通过不同结构的多聚泛素链识别底物，从而为不同的蛋白质降解途径提供降解信号[21]。

有较多研究发现E3酶在调节睾丸和精子发生过程中起到重要作用[22]。E3酶更多是被发现在精子发生过程中的组蛋白的泛素化中起作用，尤其是H2A和H2B的泛素化被认为是精子发生过程中染色质重塑的重要表观遗传标志之一[23]。组蛋白的泛素化在组蛋白与鱼精蛋白交换之前至关重要。最近发现一种H2A泛素化的新型E3酶PHF7，在精子发生过程中特异性表达，与小鼠精子发生过程中组蛋白到鱼精蛋白的交换有关[24]。尽管大量研究表明E3酶在精子发生过程中起着重要作用，但在精子获能过程中的详细的泛素化途径尚未被揭示。例如，一些蛋白质被发现泛素化，而特定的对应酶尚未被阐明。

3 蛋白酶体

最近的研究发现表明，26S蛋白酶体是真核细胞中的主要蛋白酶体，通过利用ATP分子的水解作用来修饰复杂的底物结构，从而调节细胞蛋白质组并降解许多调节蛋白以及受损或错误折叠的多肽[25]。这种ATP依赖的蛋白水解复合物由中空的圆柱形20S核心颗粒组成，在该颗粒中蛋白质被降解，结合泛素化底物的19S调节颗粒分解泛素链，然后将多肽展开并将其转运到核心颗粒中[26]。然而，越来越多的证据表明，许多泛素化蛋白结合到蛋白酶体，被去泛素化降解[27]。同样，26S蛋白酶体降解泛素蛋白的能力受到多方面调节，并且可以通过几种合成后机制改变[28]。蛋白酶体调节的形式具有重要的生理重要性。

蛋白酶体在精子获能过程中会导致精子蛋白磷酸化程度的增加。它可以直接或间接调节Ser和Thr的磷酸化，从而在获能过程中降解丝氨酸磷酸酶，苏氨酸激酶或Thr残基磷酸化的蛋白质。蛋白酶体降解的靶标是AKAP3。该蛋白将PKA锁定在精子尾巴中，在获能条件下，通过蛋白酶体机制增强了AKAP3的降解使PKA和AKAP3之间的解离和细胞内碱化作用。AKAP的解离和降解使PKA从尾巴向头部转移，从而促进了顶体反应[29]。蛋白酶体的抑制可防止牛精子获能过程中PKA诱导的AKAP3蛋白酶体降解。目前，尚不清楚AKAP3和其他蛋白酶体靶向的AKAP是在获能前被组成性泛素化，还是在获能过程中被精子内在的UPS泛素化。

蛋白酶体活性还参与精子表面蛋白的重新分布和转换，涉及到精子输卵管上皮层(MFGE8，ADAM5，AQN1)，精子-ZP结合(MFGE8，AQN1)形成以及精子质膜和卵子的融合(ADAM5)[30]。因此，精子蛋白酶体与顶体功能的关系在精子获能时就开始了，并可能影响顶体重塑以及精子与卵子的相互作用。精子蛋白酶体可能参与顶体的胞吐，发生在顶体反应期间Ca2+流入平台期的上游。这可以减少Ca2+流入的持续阶段，而不影响最初的瞬时峰值。当精子与ZP结合并发生顶体外分泌时，蛋白酶体能够降解部分ZP蛋白。具体来说，顶体外分泌导致与顶体内膜相关的蛋白酶体暴露，当精子头部通过ZP时，蛋白酶体可能提供持续的蛋白水解酶活性[31]。最近的研究通过构建计算模型清楚地表明26S蛋白酶体复合物在精子信号传导中具有活性。它参与生殖过程的所有步骤，包括精子-透明带相互作用[30]和在获能过程中发生的蛋白质磷酸化[4]，从而促使获能的精子释放出来[32]。

目前发现人类中不育男性的弱精子症和畸胎精子症伴随着精子蛋白酶体酶活性的降低和蛋白酶体激活子4(PSME4)基因在畸胎精子症患者中的表达下调[32]。目前尚不清楚这些精子是否不能进行获能和顶体胞吐，以及这种失败是否与蛋白酶体酶活性降低有关。研究表明不育患者的精浆中含有针对精子质膜中抗原的抗体。其中一些抗原被鉴定为蛋白酶体亚单位。因此，抗蛋白酶体亚单位抗体的存在可能是不育的一个原因。这样，新的发现为进一步的研究开辟了道路，可以为精子生理学提供新的信息，并为潜在的设计和治疗男性不育症的策略提供新的观点。

4 应用与展望

精子UPS的应用研究有很多领域，包括人类不育诊断检测蛋白酶体和测量蛋白酶体活性与特定荧光底物，以及通过在精子和受精中添加蛋白酶体刺激物治疗蛋白酶体相关男性不育。虽然对精子获能时的蛋白酶体蛋白水解作用知之甚少，但最近的一项研究表明，精子携带的泛素化蛋白质的蛋白酶体蛋白水解发生在睾丸后附睾精子成熟过程中[33]。此外，在哺乳动物精子中发现了多个泛素连接酶和去泛素化酶，它们可以支持睾丸后泛素化和精子蛋白质的周转[34]。通过限制不必要的自发获能，根据精子蛋白酶体活性选择繁殖公畜，冷冻精液人工授精后，利用蛋白酶体刺激成分开发培养基、扩展剂和冷冻保护剂以提高受孕率，可以提高家畜的繁殖性能，提高精液性别鉴定后的精子活力，同时减少每剂量精子的数量，以便在生产系统中使用更优质基因。