贾伟娟,张玲艳,何云江,郗姗姗,王学理
(内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古 通辽 028042)
牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD),又称牛疙瘩皮肤病、牛结节疹,是由牛结节性皮肤病病毒( lumpy skin disease virus, LSDV)引起的以病牛出现皮肤结节、发热、淋巴结肿大和水肿为主要特征的急性、亚急性或慢性传染病[1]。LSD暴发期间的发病率为3%~85%不等,而死亡率通常较低(1%~3%),但幼年动物的死亡率可能高达40%~75%[2]。LSD导致的高发病率、不同程度的死亡率与其毒株类型、媒介流行程度、宿主的年龄和免疫状态有关。该病可以导致牛皮永久性损伤、母牛流产、产奶量下降、公牛不育以及乳房炎等多种并发症,对养牛业造成严重的经济损失[3]。
LSDV是痘病毒科羊痘病毒属的一种有囊膜的双链DNA病毒,该属另外两种病毒是绵羊痘病毒(sheeppox virus, SPV)和山羊痘病毒(goatpox virus, GPV)[4]。其基因组大小约为151 000 bp,是由中央的编码区和两端长为2.4 kb的倒置末端重复序列组成,编码156个预测基因。LSDV与其他属的痘病毒比较,有146个保守基因,编码的蛋白与mRNA的合成及加工、DNA复制、病毒粒子的组装、病毒的毒力和侵染宿主范围有一定的关联。在中央基因组区域,LSDV基因与其他已知的哺乳动物痘病毒,特别是猪痘病毒和山羊痘病毒的基因氨基酸同源性为65%左右。在末端区域,共线性被破坏,氨基酸同源性为43%左右。这些差异与影响病毒毒力和宿主范围的功能基因及基因家族相关。虽然LSDV在基因和病毒结构上与疱疹病毒相似,但它也含有其他痘病毒属中发现的IL-10、IL-1结合蛋白、G蛋白偶联CC趋化因子受体和表皮生长因子样蛋白同源物。
由于环境的改变,病毒自身的结构也发生了变化。有研究表明,俄罗斯库尔干地区在2018年出现了新的变种LSDV病毒。研究发现,分离株的主链基因构成稳定,侧链基因发生了较大改变,共27个重组位点,证实该分离株属于类疫苗重组株[5-6]。
LSDV可以在羔羊、犊牛肾细胞和绵羊胚胎肾细胞等原代细胞,以及非洲绿猴肾细胞等传代细胞中增殖并产生细胞病变。感染的细胞培养物用苏木素-伊红或苏木素-玫瑰红染色,组织学观察可见细胞胞浆内有包涵体。在鸡胚绒毛尿囊膜上生长繁殖可引起痘斑,且鸡胚不死亡。病毒在55 ℃ 2 h或65 ℃ 30 min的环境下失去活性,不耐强酸、强碱,对乙醚和甲醇敏感,在正常环境温度下可以较长时间存活,在皮肤痂皮中存活时间长达40 d以上。
牛是LSDV的自然宿主,各个年龄段和品种的牛都具有易感性。该病的发生呈季节性,5月份发病率较低,10月份发病率最高。不同地区的发病率不同,在炎热干燥的低海拔地区发病率较低,反之在温暖潮湿的高原地区则发病率较高[7]。2015年,该病在埃及的发病率为8.7%,死亡率为0.4%,而在土耳其发病率为12.3%,死亡率为6.4%[8]。
1929年,LSD在赞比亚首次被报道,随后传播到苏丹和南部非洲国家,之后非洲之角暴发了很严重的疫情,导致LSD在非洲成为牛的常发疫病。1944 年,南非德兰士瓦省发生 LSD疫情,由于没有受到足够的重视,导致其在3年时间内演变成暴发性的大流行,总共感染800 多万头牛,这是目前 LSD 造成危害最为严重的一次大流行。1974年,尼日利亚报道了LSD;1976年该病传入象牙海岸,此后在非洲大陆一直呈周期性暴发。1977年利比里亚共和国和加纳共和国均报道了该病的发生。1981年,埃塞俄比亚首次出现LSD疫情。1986年该病传播到中东地区,直到2012年之前中东地区仅出现零星的少量LSD感染病例。2012年夏天,在以色列靠近叙利亚边界的戈兰高地北部发生了LSD。2012年,LSD在以色列北部开始蔓延。2012年末,黎巴嫩出现34起LSD疫情。随后,在约旦和约旦河西岸也有该病的发生。2013年,LSD在土耳其全境开始传播[9]。从2014—2015年,该病扩大到欧洲东南部和东北部,影响到高加索国家和哈萨克斯坦[10]。2015—2016年间,依次传播到俄罗斯、希腊、亚美尼亚、保加利亚和马其顿共和国[11]。2019年8月,我国在新疆维吾尔自治区伊犁州首次发现牛结节性皮肤病,2020年,我国已将其列为一类传染病[12]。随着疫病的传播和蔓延,该病逐渐威胁到其他亚洲国家和欧洲国家。
LSD最主要的传染源是病牛,其传播媒介尚不完全清楚,一直以来都认为节肢动物是最主要的传播媒介。
Sohier等[13]通过试验研究了厩螯蝇(Stomoxyscalcitrans)与麻虻属昆虫(Haematopotaspp.)是否可以将LSDV从感染牛传播给易感牛。首先给14头健康牛颈静脉注射LSDV,待出现病毒血症或牛皮肤出现结节时用其血喂养这两种吸血昆虫。之后,2种昆虫以叮咬方式感染14头易感牛, 42 d后对易感牛进行剖检。对易感牛血液、组织器官以及吸血昆虫进行实时PCR分析。结果表明,30%的易感牛血液与组织器官呈阳性,52%的吸血昆虫LSDV检测呈阳性,说明厩螯蝇和麻虻属昆虫可以通过叮咬吸血将LSDV间接传播给易感牛。
Chihota等[14]给健康牛攻毒,通过埃及伊蚊(Aedesaegypti)吸食其血液后再去叮咬易感牛。结果显示,参与实验的6头易感牛中5头出现LSD临床症状,其中4头表现为被叮咬部位肿胀以及局部淋巴结肿大;1头发热并出现结膜炎、鼻炎,同时被叮咬部位发生肿胀并形成直径约3 cm的结节。15 d之后,已出现结膜炎和鼻炎的牛在被叮咬部位周围又发现3个新的结节,最先出现的结节发展成溃疡并结痂。从所有易感牛被毛中分离病毒并进行PCR检测,结果表明被毛中均检测到了LSDV,虽然参与试验的6头易感牛中有1头牛并未表现出明显的临床症状,但在其被毛中也检测到了病毒的存在,表明埃及伊蚊参与了LSDV在牛群之间的传播。因此,在传播媒介活跃的季节适当限制牛群活动,可以有效减少传播媒介与易感动物的接触,降低该病的发病率。
Rouby等[15]在一头母牛产下的犊牛身上观察到了类似LSD的皮肤病变,这头母牛在妊娠7个月的时候曾出现LSD症状。产下的犊牛虚弱、口腔黏膜充血并伴有呼吸窘迫,36 h后出现死亡,尸检发现犊牛全身不同部位以及脏器均有大小不等的结节。PCR检测结果显示LSDV呈阳性,表明LSDV可以通过妊娠期母牛垂直传播给胎牛。
深入了解LSDV的传播机制和媒介的作用,才能有针对性地预防该病的发生,有助于在该病发生早期及时采取有效的手段切断传播途径,控制疾病的流行,从而防止大规模传播,减少经济损失。
LSD最明显的临床特征是病牛的头部、颈部、会阴、乳房、乳头等皮肤表面出现特征性皮肤结节,大多数结节坏死,结痂。皮肤结节最初是略微隆起、坚硬、微红,逐渐发展成为直径达3~5 cm的隆起、坚硬、边界清楚的结节,1~2周后,形成干燥的暗红色至黑色凹陷的中央坏死区。少数结节外观呈靶状,红色中心直径小于0.5 cm,周围有直径达1 cm的浅粉色变色区,外周有一条界线清晰的暗红线,靶样病变保持平坦,最终变为深棕色或黑色[16]。此外,受感染的动物还表现出抑郁、食欲不振、流产、流脓性鼻液、流涎、眼角膜浑浊并伴有肺炎和乳腺炎等多种并发症,最后导致无法站立[17-18]。严重感染的病牛四肢和头部水肿,产奶量明显下降。同时病牛体温升高、脉搏和呼吸频率也明显加快,导致病牛呼吸急促、精神不振[19]。
剖检可见患牛心脏肿大,心肌外表充血、出血,呈现斑块状瘀血;肝脏肿大,边缘钝圆;胆囊肿大,为正常胆囊的2~3倍,外壁有出血斑点和斑块;脾脏肿大、质地变硬,有出血状况;肺脏肿大,有少量出血点。肾脏表面有出血点,胃黏膜出血,小肠弥漫性出血,淋巴结肿大、出血,肿块周边呈胶冻样浸润[20]。
皮肤结节病理组织学检查显示,结节上完整的表皮出现气球样变性,形成微囊泡和嗜酸性胞浆内涵体。几乎所有的真皮血管壁都增厚、坏死,呈现坏死性血管炎。此外,坏死和炎性细胞浸润还延伸到血管周围皮下组织[21]。表皮水肿、充血、严重水样变性和过度角化,坏死组织周围有大量组织细胞和成纤维细胞,淋巴结严重水肿和中性粒细胞浸润。气管黏膜表面有出血点。睾丸组织水肿,有淡黄色胶状渗出物和出血点[22]。
取患病动物的皮肤结节与组织脏器进行研磨,制成混悬液。将混悬液滴在蜡板上,1 min后加入1滴pH=7.8的Tris/EDTA buffer溶液,20 s 后再加入1滴pH=7.2的10 g/L的磷钨酸溶液,10 s后,吸干多余的染色液,使用透射电镜观察病毒粒子的形态[23-24]。
常见的血清学检查方法主要为酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFAT)、琼脂扩散试验、病毒中和试验(VNT) 和凝集试验(AT)。世界动物卫生组织(OIE)推荐前4种试验方法作为标准血清学检测方法。但是到目前为止,OIE认定的标准检测方法是VNT,该方法具有高特异性和良好的敏感性,减少了高通量技术的应用。由于使用VNT处理活病毒时,不可以在常规实验室内进行,由此其应用可能面临限制[25]。IFAT具有与牛丘疹性口炎病毒和其他痘病毒抗体交叉反应增强的缺点。与上述血清学方法相比,酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为更适合于大规模有效的免疫学研究。但是,目前建立LSD特异性抗体ELISA检测方法的研究较少。
随着分子生物学检测技术的不断发展,聚合酶链式反应(PCR),基于TaqMan探针的实时PCR、TaqMan-MGB荧光PCR、重组酶聚合酶链反应(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、免疫过氧化物酶单层分析法(IPMA)等技术逐渐满足了科研人员对LSDV诊断检测的要求。
Alexander等[26]创建了一种TaqMan实时PCR检测LSDV的方法。该方法是基于LSDV044靶基因设计的,该靶基因具有特异性的识别位点,便于对分离株进行敏感性和特异性的检测。结果显示,对5个数量级的扩增效率为93%,标准偏差保持在0.11~0.23的范围内,对3个不同日期的重复测定的变异范围在0.83~1.22。是一种不需要考虑基因型,可在常规实验室操作的快速、有效、灵敏的工具,适用于基础研究或应用监测研究。聂福平等[27]参照GenBank中发表的LSDV全基因组序列,设计并合成一对特异性引物和探针,经条件优化,建立了可鉴别LSDV的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法可特异性检测 LSDV,而且与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒均无交叉反应,最低检出下限为1.48 copies/μL;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%。使用该方法对52份模拟临床样品进行检测,结果有32份模拟临床样品检测出LSDV核酸阳性,而普通PCR只检测出28份阳性模拟临床样品。表明该荧光定量 PCR的敏感性明显优于普通PCR,能够快速准确地检测LSDV,适用于临床样品的检测。Agianniotaki等[28]建立了一种针对G蛋白偶联受体基因(GPCR基因)的双定量实时PCR方法,用于检测和鉴别LSDV的野毒株和疫苗株。对野毒株和疫苗株的扩增效率分别为91.3%和90.7%,最低检测均为8个DNA片段,变异系数分别为0.3%和0.73%,可对疑似病例进行确诊,能将野毒感染动物与疫苗感染动物区分开来,可以作为疫苗接种中有效的检测工具。
基于PCR在成本、时间和设备方面的复杂性,Mwanandota等[29]建立了环介导异等温扩增技术(LAMP),在病牛中检出率为39%,而PCR检出率则为13.6%,最低检出限为8 copies/μL,且与其他病毒无交叉反应,表明与PCR相比,此方法的灵敏度更强,特异性更高,是一种简便、经济有效的检测方法,在常规诊断中使用更为快捷。Shalaby等[30]建立了检测LSDV的重组酶聚合酶链反应(RPA)方法,检测温度为42 ℃,最长15 min可检测到179个DNA片段。12份LSDV阴性样品和口疮(Orf)病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛痘病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病毒(血清型1、6和8型)的核酸样品均未观察到非特异性扩增;检测的临床敏感性与实时PCR结果一致,可在现场或检疫站用于LSDV感染病例的鉴定,是一种简便、快速的检测方法。Haegeman等[31]建立了一种新的检测LSDV抗体的免疫过氧化物酶单层分析法(IPMA),使用2种稀释浓度(1∶50和1∶300)验证该方法的可用性,结果显示,使用最低稀释浓度即可区分蓝舌病毒、口蹄疫病毒和LSDV;使用最高稀释浓度在感染后第8和15天检测,灵敏度分别为56.7%和100%。该方法也适用于SPV和GPV,表明其具有高度敏感性、特异性、灵活性和重复性,与商品化ELISA相比,该方法能够更早的在感染和接种动物中检测到LSDV抗体,且可以在低生物安全实验室操作。
常规的PCR检测方法灵敏快速,但是需要将病毒进行分离才能检测病原;LAMP分析需要4~6个寡核苷酸和至少4个结合位点,大约需要60 min才可读出结果;相反,RPA检测方法则十分快速,只需要2个引物和1个探针,在15 min内即可出现结果。IMPA虽具有高度敏感性、特异性和重复性,可该方法在使用过程中会耗费大量时间和人力,同时需要较高的成本。而特定的TaqMan检测方法,由于操作简单,高通量,敏感性和特异性强,最适合进行实验室诊断时使用。
2020年,我国在进境动物检疫疫病名录中将其列为一类传染病,到目前为止,还没有针对LSD特别有效的治疗方法[32]。
国外对于LSD采取的防控措施主要是疫苗接种与扑杀患病动物相结合来防止疾病蔓延。埃塞俄比亚出现疫情后,立即实行疫苗接种计划、扑杀患病动物并限制牲畜流动,有效的控制了该病的传播。土耳其在无疾病地区对来自疫区的牲畜、兽皮和精液进行了严格的控制[33]。印度则使用诱捕器、杀虫剂捕杀蚊、蝇、虻等媒介昆虫,来预防该病[34]。
国内对LSD预防的最佳方法是提前对高风险地区的牛群进行疫苗免疫,由于SPV和GPV疫苗株对LSDV 会产生部分交叉保护性,所以可以通过接种GPV疫苗来预防LSDV。对疫区的易感动物采取定期驱虫和消灭虫媒等措施以防止疾病发生扩散。同时在疫区要禁止放牧,并严格控制对牛群的调运。对于疑似LSD的病牛要立即向当地有关部门上报并及时将鼻拭子和痂皮等样品送检,将可疑病牛进行隔离,限制移动。一旦被确诊为LSD立即将所有病牛进行扑杀,采取深埋等无害化处理。对病牛所在县及其邻近县所有牛采用5倍剂量的GPV疫苗进行紧急免疫,并对养殖场进行严格彻底的消杀。
目前LSD对于我国来说属于新发的疫病,会危害牛以及其他野生动物。该病的发生引起了全球的广泛关注,不仅对养牛业造成经济损失而且还会给国际贸易带来一定的影响。因此,加强该病的防控显得极为重要。
基于LSDV与GPV和SPV同属,同源性极高,可以使用SPV弱毒活疫苗和GPV弱毒活疫苗进行免疫,但是要特别注意野毒株与疫苗株在体内重组的情况,一旦发生重组可能会产生毒力更强的新毒株[35]。因此,候选疫苗的安全性评估不容忽视。目前,对LSD的致病机制、传播途径和传播媒介尚不完全清楚,仍需相关机构做进一步的深入研究,我国已经出现LSD病例,所以研发安全高效的疫苗迫在眉睫,应以疫苗的创新性、安全性和有效性作为研发的重点,以用于该病的预防和根除。
随着我国与世界各国之间的贸易往来越来越密切,应严格加强口岸动物疫病的监督和管理。各级兽医部门应加大排查力度,及早进行LSD疫苗免疫接种,避免因疏于管理而造成疫情大暴发和扩散,造成不可挽回的损失。