吉林和辽宁地区80例苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

李 锦，李 晶，李娜娜，陈 宁，孟 岩，潘亭亭，张蔓丽，朱 军，田亚平 解放军总医院医学创新研究部 出生缺陷防控技术研究中心，北京 00853； 四川大学华西第二医院 国家出生缺陷监测中心，四川成都 60000

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常染色体隐性遗传的氨基酸代谢病，由苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydrozylase，PAH)活性的部分或完全缺失引起，会使苯丙氨酸在体内蓄积，导致患儿出现多系统损害[1-3]。PAH基因编码苯丙氨酸羟化酶，该基因突变可引起酶活性异常[1-3]。世界范围内，PKU发病率在性别上无统计学差异，但突变种类和频率存在明显地域和种族差异。美国白种人新生儿PKU发病率为1∶10 000，土耳其新生儿PKU发病率为1∶2 600，为全世界最高；芬兰和日本的新生儿PKU发病率最低，不足1∶100 000[4-6]。1985-2018年中国大陆研究显示PKU发病率为1∶11 144～11 614，且呈现“北高南低”趋势[7-13]。另外，欧美白种人PKU常见突变位点位于外显子12和内含子12，而中国大陆人群常见突变位点位于外显子7、外显子6和外显子12。可见PKU致病基因PAH的高度异质性[7-13]。突变种类和频率存在明显地域和种族差异，因此针对不同地域的基因突变检测是有必要的。PAH基因定位于常染色体12q23.2[14]。目前PAH突变数据库中已收录了100多种致病突变位点(http://www.biopku.org/pah)，突变类型多样，包含错义突变和无义突变(65.4%)、小缺失(11.2%)、剪切位点突变(12.8%)以及小插入(2.3%)。我国吉林、辽宁两省PAH 基因突变情况尚无相关报道。本文对80例患儿进行PAH基因1～13号外显子及其侧翼序列的一代测序，检测到的突变位点在患儿家系中进行验证，而后行突变位点分析，了解其突变特征。

对象与方法

1 研究对象 选取2016 - 2018年在吉林省妇幼保健院、长春市妇幼保健院、延边州幼保健院、松原市妇幼保健院、四平市妇幼保健院、白城市妇幼保健院、辽宁省妇幼保健院确诊为苯丙酮尿症的患儿及家系为研究对象。研究对象入选要求：1)血液及尿液标本进行苯丙氨酸浓度测定、血二氢蝶呤还原酶测定、BH4负荷试验(Phe浓度＞600 µmol/L)或Phe和BH4联合负荷试验(Phe浓度 ≤ 600 µmol/L)、尿蝶呤谱分析，确认治疗前血液苯丙氨酸浓度持续高于120 µmol/L，且排除四氢生物蝶呤缺乏症、一过性高苯丙氨酸血症和酪氨酸血症。2)年龄0～10岁。该实验已通过中国人民解放军总医院医学伦理审查，所有受试者患者及家长均签署知情同意书。对患儿进行PAH基因1 ～ 13号外显子及其侧翼序列一代测序，检测到的突 变位点在患儿家系中进行一代测序验证。

2 样本采集及DNA提取 采集患儿及父母外周静脉血2 mL，按照QIAamp®DNA Blood Mini Kit操 作流程提取样本基因组DNA。

3 PCR扩增及一代测序 PAH基因1～13号外显子区域及其侧翼序列引物序列见表1，PCR扩增条件及体系见表2，PCR产物纯化按照OMEGA®Cycle-Pure Kit说明书操作进行纯化，测序采用T hermoFisher®3500DX基因分析仪。

表1 PAH基因外显子1～13引物序列Tab. 1 Primer sequences for PKU exons 1 - 13

表2 PCR反应条件体系和扩增条件Tab. 2 PCR amplification system and amplified conditions

4 突变命名及验证 结合BIOPKU数据库(http://www.biopku.org/pah)命名已知突变点，新的突变点通过对比数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nig.gov)和BIOPKU确定为新突变。新突变命名依据HGVS命名规则(http://www.hgvs.org/mutnomen)。c代表编码蛋白的DNA序列，p代表蛋白质序列 ，参考序列为 NM_000277.3。

5 突变位点的蛋白功能预测 将突变的氨基酸序列输入到在线软件PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和SIFT (http://sift.jcvi.org)，软件自 行进行突变位点的蛋白功能预测。

6 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析，计数资料以例数和率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意 义。

结 果

1 该 地 区PAH基 因 突 变 频 率 最 高 的 位 点为R243Q 共纳入80例PKU患儿，其中男32例，女48例。我们将80例PKU患儿PAH基因外显子1 ～ 13的一代测序序列，与GenBank cDNA(GI：209364518)进行比对，而后对患者家系进行突变位点的家系验证。80例患者中15例为纯合子，64例为复合杂合子，1例为三个杂合子，共检测292个等位基因(表3、表4)。结果显示，有3个单核苷酸多态性位点(SNPs)[Q232(CAA＞CAG)、V245V(GTG＞GTA)及L385L(CTG＞CTC)]；发现了161个突变位点，占292个突变等位基因的55.14%，46种突变类型(41种集中在外显子区域，余5种位于内含子区域)。患者突变频率最高的位点为R243Q(15.75%)，其次为IVS11-3A＞T(4.11%)、R413P(3.42%)、IVS4-1G＞A(3.08%)、EX6-96A＞G(3.08%)、Y356*(2.74%)、R111*(2.74%)、R241C(2.4%)、R53H(1.03%)、IVS2 +19T＞C(1.03%)。余36种突变类型突变频率小于1%。在46种突变位点中，有29种为错义突变、7 种剪切位点突变、5种无义突变和5种小缺失。

表3 吉林和辽宁省80例患儿PAH基因外显子1～13突变点汇总Tab. 3 PAH 1-13 exon mutations in 80 cases from Jilin and Liaoning province

表4 80例患儿PAH基因突变点详表Tab. 4 Mutations identified in 80 PKU patients

2 F294S为PAH基因新发现的突变点。 我们在吉林1个家系样本中发现了新的突变位点F294S(表4、图1)，该位点之前未见报道过，其余突变位点均已被收录在 PAH Mutation Analysis Consortium Database (HGMD)数 据 库 中。依据ACMG发布的《遗传变异分类标准与指南》进行评估。该位点为错义突变，附近的51对碱基所报道的变异有16个致病性0个良性变异，位于已知无良性变异的关键功能域，符合证据PM1。在gnomAD外显子和基因库中均未记录该变异位点，人群数据库中缺失，符合证据PM2。苯丙酮尿症为常染色体隐形疾病，该患者确证为苯丙酮尿症，且经一代验证患者F294S突变为父源突变，另一突变点R111*为母源突变，符合证据PM3。此外，我们分别用在线软件PolyPhen-2和SIFT进行突变位点的蛋白功能预测，PolyPhen-2结果显示为Probably Damaging(很可能损害)，Hum Var结果的分数越接近1.0，损害的可能性就越大(图2)；SIFT结果显示Damaging(有害)(图3)，符合证据PP3。该突变点符合3个中等(PM1、PM2、PM3)和1个支持(PP3)证据，依据指南，目前致病性评估为可能致病(likely pathogenic，LP)。

图1 F294S一代测序验证结果A：患儿F294S电泳结果：Exon8 c.881T > C，p.F294S，杂合突变；B：患儿父亲相同位点一代验证电泳结果：Exon8 c.881T> C，p.F294S，杂合突变；C：患儿母亲相同位点一代验证电泳结果，为野生型Fig.1 Sanger Sequencing results of the F294S mutation A: The electropherogram of the patient sample shows one adenine nucleotide missense mutation in a heterozygotea manner; B, C: The electropherogram of the patient's father and mother samples, respectively

图2 PolyPhen-2对突变点的预测Fig.2 This mutation is predicted by PolyPhen-2

图3 SIFT对突变点的预测Fig.3 This mutation is predicted by SIFT

讨 论

迄今，人类有8000余种单基因病被发现，其中由PAH基因突变导致的PKU是中国最常见的新生儿单基因遗传代谢病之一[15]。目前尚无方法可以根治PKU，最常见的方法是在新生儿筛查中做到“早发现早治疗”，减少对患儿生长发育及智力发育等方面损害。因此快速、有效、精准的基因诊断对PKU患儿的尽早治疗十分有意义。PAH基因的突变类型有明显的地域和种族差异，因此针对不同地区的PKU患儿发现当地PAH基因突变特点，寻找突变热点，有助于患儿的早期诊断，对患儿家族的再生育有指导意义。

在此次检测中，我们检测了80例来自吉林辽宁省的PKU患儿家系，发现了46种突变类型，其中R243Q突变频率最高(15.75%)，随后是

IVS11-3A＞T、R413P、IVS4-1G＞A和EX6-96A＞G(4.11%、3.42%、3.08%、3.08%)。欧美白种人PAH常见突变位点位于外显子12(R408W)和内含子12(IVS12 + 1G＞A)[16-17]；亚洲国家，伊朗突变热点IVS10-11G＞A[18]，日本常见突变位于R413P、R243Q和R241C[19]，朝鲜主要类型为IVS4-1G＞A和R243Q[20]，中国台湾最常见的PAH突变是R241C(36%)[21]。本研究人群的突变热点依然位于外显子7(R243Q)，这也支持之前研究的结论，与前期中国大陆的突变位点南北差异趋势相符，中国大陆人群常见突变位点位于外显子7、外显子12和外显子6(R243Q、EX6-96A＞G、V399V、R241C、R111*、Y356*、R413 P和IVS4-1G＞A)[22-23]。但此次研究的R241C(2.4%)高于IVS7 + 2T＞A(0.34%)，与以往研究略有不同。在此前研究中R241C，R408Q和p.Y166*南方人群略高，推测可能与观测样本量的数目有关。在致病性突变中，与无义突变、剪切位点突变、小缺失、小插入和大片段缺失相比，错义突变仍是最常见的致病突变。本组观察到46种突变，有29种为错义突变，这一点与前期研究相符。

此外我们发现了PAH基因一个新的突变位点F294S，该位点未在BIOPKU数据库中记录。突变点F294S位于8号外显子，为错义突变，编码区c.881核苷酸由胸腺嘧啶(T)变为胞嘧啶(C)，引起第294号氨基酸错义突变，由苯丙氨酸(phenylalanine/phethe)变为丝氨酸(serine/ser)，该位点所在区域为无良性变异的功能域，极有可能引起苯丙氨酸羟化酶结构改变和酶活性降低。目前我们依据ACMG发布的《遗传变异分类标准与指南》进行评估，该位点为可能致病，后续随着病例积累，如该位点频率显著高于对照，可符合证据PS4；完善功能研究表明有害作用，可符合证据PS3；已完整鉴定的致病变异有相同氨基酸改变，符合证据PS1。符合上述其中的一条，该变异致病性可上升为致病。

目前吉林、辽宁两省PAH基因突变情况还没有报道过。本研究只是针对PAH基因进行一代测序检测，显示点突变、小缺失/插入/重复，对于PAH基因大片段缺失无法检测到，可继续补充MLPA检测方法；新的突变点可以进行功能验证。尽管PKU无法治愈，目前公认早发现、早诊断、早治疗可以延缓病情进展[24]。患儿出生后通过严格的饮食限制或饮食结合药物治疗，将外周血苯丙氨酸浓度控制在正常水平，不会出现神经系统发育异常[25]。综上，本研究发现吉林、辽宁地区80例PKU患儿PAH基因的突变特点，同时发现一个新的突变位点F294S，为该地区预防PKU出生缺陷提供了一定的参考。