口服丙酮酸钙盐糖液对重度烧伤大鼠伤后早期氧合脏器功能及生存率的影响

刘翔宇，柴家科，刘 甜，黄健翔，曲毅睿，胡吉林，胡方超，迟云飞，畅 阳解放军总医院研究生院，北京 100853； 解放军总医院第四医学中心 全军烧伤研究所，北京 100048

严重烧伤休克是烧伤患者早期常见的死亡原因[1]。尽早止血和给予液体复苏是救治休克的关键措施。有统计结果表明，液体复苏实施的越早，救治存活概率就越大[2]。但在灾害现场抢救中，因场地受限、医疗资源缺乏，静脉补液难以立即展开，导致伤员并发症及死亡率大大增加。在无静脉补液条件下，口服补液是一种高效的复苏手段。近年来研究表明采用丙酮酸盐救治烧伤导致的低血容量休克疗效较好[3-6]。丙酮酸盐与胃酸作用可生成具有抗休克作用的丙酮酸根，其进入机体可提高组织和细胞对缺氧环境的耐受性，抑制细胞凋亡，保护重要脏器器官功能，抗休克效果优于WHO推荐的口服补液盐[7]。但目前研究最多且最常用的丙酮酸盐——丙酮酸钠口服安全性低，这使其口服制剂向临床过渡面临重重困难。丙酮酸钙是丙酮酸的钙盐，广泛存在于苹果、奶酷黑碑、红酒等食品中，其食字号产品已上市，食用安全性高，可使丙酮酸安全进入机体发挥抗休克作用，所以丙酮酸钙应用于口服液体复苏具有广阔前景。目前国内外尚无丙酮酸钙用于抗休克的相关研究，其复苏效果还不完全清楚。基于以上研究背景，本实验将丙酮酸钙引入经典的WHO口服补液盐Ⅲ中，配制出了新型丙酮酸钙盐糖液，探讨其对重度烧伤后早期缺血缺氧状态、抗氧化能力、脏器功能及生存率的影响；将口服丙酮酸钙盐糖液与腹腔补乳酸盐林格液的疗效进行对比，初步评价其在院前急救阶段复苏中的应用价值。

材料与方法

1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠210只，6～8周龄，体质量210～230 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。在解放军总医院第四医学中心动物实验室恒温(25±3)℃、恒湿(50±5)%条件下适应性饲养1周，实验前禁食12 h，禁水4 h。本研究经解放军 总医院实验动物伦理委员会批准。

2 主要仪器及试剂 便携式血气分析仪(OPTI Medical公司，美国)；VT-5600自动生化分析仪(强生公司，美国)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；乳酸盐林格液购自国药控 股北京天星普信生物医药有限公司。

3 口服液体配制方法 丙酮酸钙盐糖液配制：参照文献[8]中的方法配制丙酮酸钙盐糖液：取WHO推荐的口服补液盐Ⅲ 4包，称量6.8 g丙酮酸钙，溶于1 000 mL饮用水中，每次现用现配，使 用前置于37℃恒温水浴箱预热。

4 动物模型制备与分组 选取130只雄性Wistar大鼠(6-8周龄)，按照随机数字表法分为假伤组(Sham组，n=30)、单纯烧伤组(Burn组，n=60)、口服补液组(OR组，n=60)和腹腔补液组(PR组，n=60)。Sham组(n=30)大鼠用3%戊巴比妥按照40 mg/kg的剂量麻醉后，37℃水浴浸泡背部12 s，腹部6 s；其余三组(每组60只)大鼠用3%戊巴比妥以同样剂量麻醉后，94℃沸水浸泡背部12 s、腹部6 s，致50%总体表面积Ⅲ度烧伤(经病理切片证实，为严重烧伤)[9-11]。OR组采用灌胃输入丙酮酸钙盐糖液的方法口服补液，PR组采用腹腔注射乳酸盐林格液的方法腹腔补液，两组均于伤后即刻开始补液。补液量和速度依据Parkland公式(烧伤后第一个24 h补液量=体质量(kg) × 烧伤面积(%) × 4 mL，前8 h补液量为第一个24 h补液量的一半)，每2 h严格按照计算所得补液量进行补液，总共补液8 h。Sham组自由饮水，Burn组不 予补液。8 h后各组均自由进食水，不再补液。

5 生存率观察 每组各取20只大鼠，观察24 h，每30 min观察1次，详细记录动物的状态和死亡时 间，计算各组大鼠生存率。

6 相关指标及病理检测 选取造模后0.5 h、4 h、8 h、24 h四个时间点，每个时间点从各组选取10只大鼠采集腹主动脉血，用便携式血气分析仪测量血气分析指标，包括pH值、动脉血氧分压(partial pressure of oxygen in artery，PaO2)、动脉血二 氧 化 碳 分 压(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、剩余碱(base excess，BE)、血乳酸(lactic acid，Lac)；用自动生化分析仪测量脏器功能指标，包括谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、血肌酐(serum creatinine，CR)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)；用Elisa法测量氧化应激指标，包括MDA、DAO、SOD、T-AOC；取心、肝 、肺部分组织行HE染色检测组织病理变化。

7 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件，计量资料以 x ¯±s表示，组间比较采用单因素方差分析和两独立样本t检验。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用log-rank检验。P＜0.05为 差异有统计学意义。

结 果

1 造模情况 大鼠造模后无死亡。在各时间点放血处死大鼠后，取背部和腹部烧伤区域皮肤进行病理检测，病理结果证实烧伤深度符合建模要 求。

2 各组生存率比较 伤后24 h内，Sham组生存率100%。伤后8 h，OR组生存率(70%)与PR组生存率(75%)差异无统计学意义(χ2=0.18，P＞0.05)，且均高于Burn组的55%(χ2=0.64、1.58，P＞0.05)。伤后24 h，OR组生存率(70%)与PR组生存率(75%)均显著高于Burn组(30%)，差异均有统计学意义(χ2=4.37、6.54，P＜0.05)。K aplan-Meier生存曲线见图1。

图1 各组重度烧伤大鼠Kaplan-Meier生存曲线图Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of severely burned rats in each group

3 血气分析指标 1)pH值：伤后0.5 h，三个致伤组pH值均降低，4 h后均回升至正常范围，四组pH值差异均无统计学意义(P＞0.05)。伤后8 h、24 h，Burn组pH值明显下降，其他三组pH值均在正常范围内，Burn组与其他三组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。2)PaO2：伤后0.5 h，Burn组、OR组、PR组氧分压均低于Sham组(P＜0.05)。伤后24 h，Burn组氧分压明显降低，与其他三组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。3)PaCO2：伤后0.5 h，三个致伤组均降低，与Sham组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。伤后4 h、8 h、24 h，Burn组PaCO2明显增高，各时间点与其他三组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。4)BE：伤后0.5 h，三个致伤组BE负值明显增大。伤后4 h、8 h，OR组和PR组BE负值呈现逐渐减小的趋势，Burn组BE逐渐增大，与OR和PR组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)(表1)。5)Lac：伤 后4 h、8 h、24 h，Burn组血乳酸值明显升高，各时间点与其他三组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。伤后4 h、24 h，OR组和PR组Lac值高于Sham组(P＜0.05)(表1)。

表1 各组大鼠各时间点血气分析指标比较(n=10)Tab. 1 Comparison of blood gas analysis indexes of rats in each group at each time point (n=10)

4 各组脏器功能指标比较 1)ALT：三个致伤组均逐渐升高，但四个时间点三组间比较差异均无统计学意义(表2)。2)AST：伤后0.5 h，三个致伤组均升高，PR组增幅最大，与OR组比较差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。3)CR：伤后4 h，三个致伤组均明显高于Sham组(P＜0.05)；伤后8 h、24 h，三个致伤组CR值均下降，Burn组高于其他三组(P＜0.05)(表2)。4)BUN：伤后0.5 h、4 h、8 h、24 h，三 个 致 伤 组 均 高 于Sham组(P＜0.05)；伤后4 h、8 h、24 h，Burn组BUN值逐渐升高，而OR组、PR组BUN值逐渐下降(表2)。5)CK-MB：伤后0.5 h、4 h、8 h、24 h，三个致伤组均高于Sham组(P＜0.05)；伤后8 h、24 h，Burn组CK-MB值高于OR组、PR组(P＜0 .05)(表2)。

表2 各组大鼠各时间点脏器功能指标比较(n=10)Tab. 2 Comparison of organ function indexes of rats in each group at each time point (n=10)

5 各组氧化应激指标比较 1)MDA：伤后4 h，三个致伤组MDA值明显高于Sham组(P＜0.05)；伤后8 h，三组MDA值均降低，但仍高于Sham组，仅Burn组与Sham组比较差异有统计学意义(P＜0.05)(表3)。2)DAO：伤后0.5 h，Burn组和PR组DAO值高于Sham组(P＜0.05)；伤后4 h、8 h，Burn组DAO值逐渐升高，与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；伤后24 h，四组DAO值组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)(表3)。3)SOD：伤后4 h、24 h，OR和PR组SOD值均明显高于Sham组和Burn组(P＜0.05)(表3)。4)T-AOC：伤后8 h、24 h，OR组T-AOC值高于Burn组和PR组(P＜0.05)，与Sham组差异无统计 学意义(P＞0.05)(表3)。

6 各组大鼠组织病理学变化比较 1)Sham组大鼠心(图2A)、肝、肺组织结构完整、清晰，无水肿、渗出及出血。2)Burn组在伤后0.5 h各组织即可见充血、水肿及炎症细胞浸润(图2B)，且随着时间的延长，上述病变逐渐加重并出现出血(图2C)，伤后24 h可见心肌纤维排列紊乱、断裂，间距增宽，心肌间质水肿、出血严重，心肌细胞肿胀(图2A)；肺组织肺泡结构破坏，肺间质水肿、出血，肺泡壁明显增厚，炎症细胞渗出，肺泡腔内可见少量水肿液渗出；肝组织细胞明显肿胀，肝窦间隙增宽，门脉区血管周围带肝细胞出现大量脂滴，可见小片状溶解性坏死。3)PR组伤后0.5 h病理变化与Burn组差异不大，心尖组织可见心肌纤维间距增宽，少量心肌细胞肿胀(图2D)，肝组织可见肝窦变窄，少量肝细胞发生脂肪样变性，肺组织肺泡壁增厚，间质少量充血、水肿及炎症细胞渗出，但随着伤后时间的延长，PR组未发生明显病情进展，未出现更严重的组织结构破坏(图2E)。4)OR组伤后0.5 h的组织损伤程度与Burn组、PR组无明显差异，可见心尖组织中少量心肌细胞肿胀及少量渗出(图2F)，肝组织可见肝细胞肿胀及脂肪样变性，肺组织肺泡壁稍增厚，间质少量充血、水肿及炎症细胞渗出。在伤后4 h、8 h、24 h，OR组未发生明显病情进展，未出现更严重的组织结构破坏(图2G)。

图2 大鼠心尖组织病理形态学观察(HE染色，200×)A: Sham组心尖组织；B: Burn组伤后0.5 h心尖组织；C: Burn组伤后24 h心尖组织；D: OR组伤后0.5 h心尖组织；E:OR组伤后24 h心尖组织；F: PR组伤后0.5 h心尖组织；G：PR组伤后24 h心尖组织Fig.2 Pathomorphological observation of apical tissue of rats (HE staining, 200×)A: The apical tissue of Sham group; B: The apical tissue of Burn group at 0.5 h after injury; C: The apical tissue of Burn group at 24 h after injury; D: The apical tissue of OR group at 0.5 h after injury; E: The apical tissue of OR group at 24 h after injury; F: The apical tissue of PR group at 0.5 h after injury; G: The apical tissue of PR group at 24 h after injury

讨 论

无静脉补液条件下行口服补液具有以下优点：首先其配制简单、携带方便；其次，对无菌的要求相对较低，且不需要静脉穿刺、注射等医学技能，将其用于战场火线救治或灾害现场急救，既可缓解医疗资源不足的压力，又可节省救治时间[12-13]。目前，最常用的口服补液溶液是WHO推荐的以葡萄糖-电解质溶液为主要成分的ORS液，该溶液经口服后可被肠道有效吸收，在治疗严重腹泻方面效果良好[14]。有学者将其应用于烧伤休克的防治中，发现其存在一些不足：对休克缺血缺氧状态改善不足，尤其是对乳酸性酸中毒状况改善不足[8,15]。烧伤休克与其他休克不同的是在补充血容量的前提下，需要改善组织氧供[16]，所以有必要对ORS液进行改进，在达到扩容的前提下，提高组织耐氧，改善氧供。丙酮酸盐在化工、食品和实验医学等领域应用广泛，近年研究发现丙酮酸钠可抑制烧伤及休克后肠上皮细胞紧密连接蛋白降低、氧自由基含量降低、HIF-1水平增加，保护和改善肠屏障功能及缺血再灌注损伤，并能改善严重感染、烧伤、多器官功能障碍综合征等致死性动物模型的存活率[17-21]。但丙酮酸钠目前尚无食字号的产品上市，口服安全性仍有待大量多中心的临床研究进一步验证，这使得其难以进一步广泛应用于临床。

本实验采用已有食字号产品上市的丙酮酸钙替代了丙酮酸钠，制备了新的丙酮酸钙盐糖液。目前相关研究已证实烧伤体表总面积40%以下的动物经胃肠道补充丙酮酸钠盐糖液能被充分吸收[22]。烧伤体表总面积在40%以上时，胃肠道因严重缺血蠕动减弱，对口服补液的排空和吸收能力显著降低，而直接影响口服补液治疗的效果。胡森等[23]的研究证明50%体表总面积Ⅲ度烧伤犬口服葡萄糖-电解质液也可改善休克状态，而针对口服丙酮酸钙盐糖液进行液体复苏的研究尚未见国内外报道，在40%以上体表总面积烧伤伤情条件下其是否可改善休克状态也并不明确，所以本实验在50%体表总面积Ⅲ度烧伤的大鼠模型基础上，对丙酮酸钙盐糖液的复苏效果进行了初步探究。实验结果显示，在伤后0.5 h，三个烧伤组均呈现出氧合功能下降、脏器功能受损及氧化损伤加重等情况，伤后4 h、8 h，Burn组各项指标明显恶化，即使在伤后8 h自由进食水，但也由于前期发生休克，机体缺血缺氧，脏器灌注不足，且氧化损伤较重，而导致伤后24 h各项指标恢复并不理想，且死亡率进一步增加。伤后4 h、8 h、24 h，OR组pH值、PaO2、BE、PaCO2、Lac、CR、BUN、CK-MB、MDA、DAO、SOD和T-AOC较Burn组均有明显改善，组织病理可见组织损伤较Burn组明显好转，24 h生存率也明显提高，且其肝功能指标ALT和AST均值也较Burn组有所下降，但差异并不明显，针对肝功能的影响还需要后续进一步实验验证。

腹腔补液作为静脉补液的另一种替代手段，近些年也受到广泛关注。腹膜是人体面积最大的浆膜，其上密布毛细血管及淋巴管，具有强大的吸收能力和转运能力[24]。近年来研究表明，腹腔补液可有效增加循环血量、组织灌注，减轻组织水肿及炎症反应，应用于休克的救治具有广泛前景[25-27]。本实验也设置了腹腔补液组，并选取了临床上最常用的复苏液乳酸盐林格液，拟比较口服补液和腹腔补液这两种复苏方式的复苏效果。实验结果显示，OR组和PR组氧合指标、脏器功能指标、氧化应激指标及组织病理方面较单纯烧伤组均有一定程度的改善，且二者起到的复苏效果相似，PR组24 h生存率略高于OR组，但差异无统计学意义。且OR组前期死亡数量较多，多由于致伤后胃肠功能损伤使得口服复苏液排空不畅、吸收不足。此外早期复苏时麻醉尚未完全苏醒，未苏醒的大鼠给予口服补液易发生呕吐现象，由此引发的反流误吸也导致了OR组早期死亡率的增加。但在伤后2 h麻醉基本完全苏醒后，OR组死亡率逐渐降低，伤后2 h至伤后8 h，OR组死亡率低于PR组。在复苏效果方面，OR组还显现出一些优势。OR组血乳酸值伤后24 h各时间点均在正常值范围内，且较PR组改善显著；伤后各时间点三个烧伤组肝功能均异常，但在伤后8 h、24 h，OR组AST值明显低于PR组；在氧化损伤指标方面，伤后8 h、24 h，OR组T-AOC较PR明显升高。这些都表明口服新型丙酮酸钙溶液在改善组织灌注、保护肝功能、提高机体抗氧化能力方面有其优势，但其复苏效果还需更多实验来进一步证明。

本实验仍存在一些不足：1)没有进行血流动力学和尿量的相关监测，不能充分评估补液组有效循环血量是否充足；2)缺少致伤后胃排空功能和肠吸收功能的评价，随着烧伤面积的增加及病情的加重，伤后胃肠道的吸收和排空功能均会进一步降低，还需进一步评估在50%重度烧伤条件下大鼠的胃排空和肠吸收功能变化，以确定伤后胃肠道的有效吸收量，进而可更有针对性的定量补液；3)选取的观察时间点相对较短，只是初步的效果探索，且缺少对不同复苏方式应用同种复苏成分的效果比较。下一步还需选取同种液体成分进行研究，全面评价不同复苏方式的差异，并扩大样本量，延长观察时间，在与人生理更加接近的大动物模型上做进一步的效果验证，进而全面评价口服丙酮酸钙溶液的复苏疗效。

综上所述，本研究结果表明口服丙酮酸钙盐糖液可改善重度烧伤大鼠伤后的缺血缺氧状态，改善氧合状况并保护脏器功能，减轻脏器的氧自由基损伤，提高机体的抗氧化能力，提高重度烧伤大鼠24 h生存率，其与腹腔补充乳酸盐林格液的复苏效果相近，且在改善组织灌注、机体抗氧化能力等方面稍优于腹腔补充乳酸盐林格液，用于灾害现场的紧急救治具有广泛前景。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。