不同水稻花粉育性耐高温的差异比较研究

王思瑶,田清源,张林安,李佳馨,郭沙沙,毛丹丹,陈良碧

(湖南师范大学生命科学学院作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室，中国湖南长沙410081）

水稻高温热害指气温超过水稻发育生理温度上限,影响水稻正常开花结实,造成结实率降低甚至绝收的一种农业气象灾害[1]。水稻的生长周期较长,生殖生长阶段对高温更为敏感,当温度超过35℃时,2 h的高温就能使水稻育性显著降低。高温影响下,水稻花粉生长过程中由于水稻内环境甚至细胞结构被破坏,花粉发育不良,花粉活力降低。花粉母细胞减数分裂期是水稻对高温最为敏感的时期,期间对水稻造成的伤害多为不可逆。其次是抽穗开花期,再次是灌浆初期和中期[2]。如果花期遭受高温天气,会导致水稻花粉育性下降,花药开裂不全,柱头沾染花粉粒数降低,花粉管萌发受阻等现象发生[3～6]。

周海等[7]在研究温敏核不育系的育性基因调控时发现,温敏核不育系水稻的TMS5基因突变后,其编码的RNase Zs1失去降解UbL40的mRNA能力,高温条件下UbL40的mRNA大量积累,导致花粉不育；21℃较低温度条件下,温敏核不育系UbL40表达水平低,花粉可育。该研究结果表明,UbL40是响应高温而表达的基因,且与花粉发育有关。因此,常规水稻中该基因的表达是否响应高温,以及该基因的表达是否与花粉发育耐高温有关是一个值得探讨的问题。

本研究在高温条件下对190份水稻资源材料的花粉育性进行比较,并在此基础上分析UbL40基因的表达规律与水稻花粉育性的关系,旨在促进对水稻花粉耐高温分子机制的认识和耐高温水稻的选育。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的190份材料都为一季稻,其中107份为父本材料,由湖南师范大学生命科学学院作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室提供。

1.2 水稻材料的种植

实验在湖南长沙湖南师范大学水稻实验基地(北纬 28.12°,东经 112.59°,海拔 45 m)进行。共设置3个播种期,分别为4月15日、4月30日和5月15日。采取盆栽种植,每盆插10株(桶口内径27.2 cm,高17.5 cm),每材料每期种植3盆。以7月中旬到8月中旬的盛夏高温阶段抽穗开花的材料为研究对象。温度记载采用温湿度记录仪自动记录。

1.3 花粉育性的鉴定

水稻始穗开花期选取稻穗的上、中、下各部3个颖花的花药,用碘化钾溶液制片,在光学显微镜下观察花粉育性并计数和拍照。

1.4 水稻结实率的统计

成熟期每材料取5株统计总粒数和实粒数,计算结实率。结实率(%)=实粒数÷总粒数×100%。

1.5 水稻花药RNA的提取

取剑叶叶枕距为1 cm±1 cm的水稻幼穗,在冰上取花药,液氮速冻后-80℃保存。一次取适量(约100 mg)花药置于研钵的液氮中研磨。将粉末转移至已加入1 mL Trizol的1.5 mL EP管中,混匀后冰上静置5 min。加入1 mL的氯仿,充分振荡后冰上静置15 min,然后12 000 r/min、4℃离心15 min。转移上清至另一1.5 mL EP管中,加入等体积的异丙醇,轻柔颠倒混匀后,于4℃或者-20℃静置10 min,沉淀RNA。4℃、12 000 r/min离心10 min,弃上清液。用预冷的75%乙醇重复洗涤沉淀,干燥后加入20 μL DEPC水,于60℃水浴锅水浴10 min,使RNA充分溶解。吸取2 μL RNA于Eppendorf公司紫外分光光度计中检测RNA纯度与浓度,其余放置-80℃冰箱备用。

1.6 水稻花药RNA反转录和定量PCR

水稻花药RNA反转录和对目基因的定量PCR(real-time PCR)及检测分别按反转录试剂盒(AT311-02 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix,北京全式金生物技术有限公司)和2×SYBR Green qPCR Mix(北京艾德莱生物有限公司)试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 不同水稻花粉育性耐高温的差异比较

在水稻抽穗前后经历10 d持续自然日平均气温34.7℃高温条件下,190个水稻材料的花粉育性和结实率差异显著,可分为耐高温和不耐高温两大类型,其中不耐高温材料中又可分为花粉染败、花粉典败和无花粉3种高温敏感型(表1)。

耐高温水稻品种包括MCQA8等36个(表1、图1)。高温条件下耐高温水稻的花粉可染率为95.2%～97.3%,结实率为87.7%～94.1%(图2),日平均气温25.1℃的适温条件下,花粉可染率为96.1%～98.9%,结实率93.2%～99.5%。该结果说明耐高温水稻在不同温度条件下,花粉育性和结实率变化不大。

图1 不同温度条件下水稻花粉育性比较Fig.1 Comparison of pollen fertility in rice under different temperature conditions

图2 高温条件下不同水稻品种结实性状比较(A)结实穗表型；(B)结实率(n=3)。Fig.2 Comparison of seed-setting traits of different rice varieties under high temperature(A)Spike phenotypes；(B)Seed-setting rates(n=3).

在高温条件下,花粉染败率增加、结实率下降的水稻品种有华恢1006等135个,花粉可染率为11.3%～73.3%,结实率为13.0%～61.8%；在适温条件下,花粉可染率为78.8%～98.5%,结实率为87.2%～98.4%。高温条件下花粉以典败为主的水稻有MZQA2等4个,其在适温条件下育性正常。高温条件下,镜检无花粉、结实率为零的水稻有YWQB3等15个,其在适温条件下育性正常。

2.2 不同温度条件下水稻幼穗中TMS5基因的表达差异比较

TMS5(thermo-sensitive genic male sterile 5)基因突变导致温敏核不育系花粉不育[8～9]。为了探究常规稻在不同温度条件下该基因的表达有否差异以及与花粉育性有否关系,选取耐高温品种MZQA8、MCQA2以及不耐高温的华恢1006(部分花粉染败,结实率中等)、638和越1000父(无花粉型,结实率为零)为材料,比较不同温度条件下TMS5基因的表达差异。结果显示:在不同温度下各水稻品种材料幼穗中均有TMS5基因的表达(图3),高温条件下TMS5的mRNA表达水平是适温条件下的2～3倍,说明该基因对高温有一定响应,但花粉耐高温和不耐高温的水稻之间该基因的表达水平没有明显差异,即该基因的表达水平与水稻花粉育性的相关性不高。

图3 不同温度条件下水稻幼穗中TMS5基因mRNA的相对表达水平比较Fig.3 Relative expression levels of TMS5 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions**:P＜0.01.

2.3 不同温度条件下水稻幼穗中UbL40基因的表达差异比较

温敏核雄性不育系水稻幼穗中UbL40基因的mRNA表达水平随着温度的升高而增加,UbL40的mRNA累积导致温敏核雄性不育[7～8]。以安农S-1为阳性对照,对几个代表性耐高温和不耐高温常规水稻品种幼穗中UbL40的mRNA水平进行比较分析,结果表明,各水稻幼穗在不同温度下均有UbL401基因的表达,且高温条件下UbL401的mRNA含量高于适温条件下的含量。耐高温的MZQA8和MCQA2中UbL401的mRNA相对表达水平明显低于不耐高温的华恢1006,而华恢1006的mRNA相对表达水平又低于无粉型的638、越1000父。这些结果说明,UbL401的mRNA相对表达水平与水稻花粉的可育性呈现负相关(图4)。

图4 不同温度条件下水稻幼穗中UbL401基因的相对表达水平比较Fig.4 Relative expression levels of UbL401 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

UbL402基因包括UbL402a和UbL402b两种同源异构体。在高温与适温条件下,水稻幼穗中均有UbL402基因表达,且高温条件下表达水平都升高。但不同水稻间UbL402a的mRNA相对表达水平无明显差异(图5A),而UbL402b的mRNA相对表达水平与水稻育性呈负相关(图5B)。

图5 不同温度条件下水稻幼穗中UbL402a(A)和UbL402b(B)基因的相对表达水平比较Fig.5 Relative expression levels of UbL402a(A)and UbL402b(B)mRNAs in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

水稻中 UbL404基因分为 UbL404a、UbL404b和UbL404c。耐高温和不耐高温水稻中UbL404a、UbL404b和UbL404c基因都有表达(图6),表达水平都是适温条件下低,高温条件下高,但不同水稻间UbL404a、UbL404b的相对表达水平没有明显差异,而UbL404c的相对表达水平(图6C)与水稻花粉育性呈负相关。

图6 不同温度条件下水稻幼穗中UbL404基因的相对表达水平比较(A)UbL404a基因mRNA；(B)UbL404b基因mRNA；(C)UbL404c基因mRNA。Fig.6 Relative expression levels of UbL404 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions(A)UbL404a mRNA；(B)UbL404b mRNA；(C)UbL404c mRNA.*:P＜0.05,**:P＜0.01.

以上结果表明,在常规水稻的幼穗中UbL40是受高温诱导的基因,对于不耐高温的水稻,其花粉败育可能与UbL401、UbL402b和UbL404c的高表达有关。

3 讨论

高温对世界主要粮食作物特别是水稻的生产造成极大的威胁。探索高温的影响机制,筛选和培育耐高温的水稻品种是水稻科学研究的重要方向。本研究对190份水稻花粉育性耐高温的差异进行了比较分析,发现受试水稻中大多数品种的花粉发育对高温敏感,结实率低。这类花粉发育不耐高温的水稻品种在长江中下游作为一季稻种植存在较大风险,因为一季稻的花粉发育时期遇35℃以上高温的频率高。本研究鉴定出的耐高温MZQA8、MCQA2等材料可作为长江中下游一季稻耐高温育种的基因源。

周海等[7～9]研究发现,TMS5基因编码的RN-ase ZS1在野生型水稻中降解UbL40基因的mRNA,从而使水稻中的该mRNA保持在较低的水平。温敏核不育系(如安农S-1)中TMS5基因发生单碱基突变,不能产生活性RNase ZS1,在较高温度条件下导致UbL40的mRNA积累,使不育系花粉败育；在低温条件下,由于UbL40表达降低,不育系花粉可育。周海等的研究还发现,TMS5基因编码的RNase ZS1在各组织的表达属于组成型表达,其mRNA在高温和低温条件下都在花粉的小孢子母细胞(MMC)中相对富集,并不受低温(23℃)或高温(28℃)条件的影响,因而被认为是一个非温敏基因。但本研究表明,在高温逆境条件下TMS5基因的表达对高温有一定响应,推测这种响应可促进其对UbL40基因mRNA的降解,有利于花粉的发育,但耐高温和不耐高温水稻在高温条件下该基因的表达没有明显差异,故TMS5基因是决定温敏核不育系花粉育性的关键基因,而不是决定常规水稻花粉发育能否耐高温的关键基因。常规水稻花粉发育是否耐高温与UbL40基因有关,即在常规水稻的幼穗中UbL40受高温诱导表达,其中UbL401、UbL402b和UbL404c的过高表达导致不耐高温的水稻花粉发育不良,结实率降低。相关分子机制有待进一步深入研究。