双高低温敏核不育水稻的鉴定和应用研究

张 霖,刘 艳,刘 欢,向志攀,陈依君,陈慧玲,戴小军,毛丹丹,梁满中,陈良碧

(湖南师范大学生命科学学院作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室,中国湖南长沙410081)

当前,我国水稻杂交育种主要利用的是高温不育、低温可育的两用温敏核不育系。该类不育系的技术缺陷是当用于杂交制种区的温敏核不育系在花粉母细胞至减数分裂期遇到低于23.5℃低温时,不育系恢复可育性,导致杂交制种失败[1]。20世纪80年代,研究者们选育出了一批育性转换具有“低温不育,高温可育”特点的不育系种质资源,并命名为低温敏核不育系。由于其育性转换特点与温敏核不育系的育性转换特点相反,因此又称为反温敏核不育系[2]。低温敏核不育系能有效解决温敏核不育系在低温条件下制种不安全的问题。

目前,研究者选育出的低温敏不育水稻品种主要有雁农 S、G0543S、滇寻 1 号、N10S、N13S 等。李继开等[3]研究发现雁农S在辽宁地区的育性转换临界温度在28℃以上。陈良碧等[4]认为低温敏水稻N10S、N13S的育性转换敏感期在花粉母细胞减数分裂期。蒋义明等[5～6]研究认为滇寻1号的临界温度在22℃左右,育性转换敏感期在花粉母细胞形成期至双核花粉发育期。吴厚雄等[7]研究表明G0543S的临界不育温度是29.5℃,花粉母细胞形成至减数分裂期是育性转换敏感期。蔡义东在对G0543S进行不同温度处理的基础上,对各生理生化指标进行了测量,发现各激素的含量在育性转换敏感期有明显改变,导致物质的新陈代谢过程被破坏,进而使花粉发育不正常,花粉败育[8]。但到目前为止,相关研究还没有建立不育系的鉴定方法和鉴定标准,也没有确定适宜的安全制种区域和高产繁殖区域。本研究以制备的近等基因系低温敏核不育水稻为材料,分析不同低温敏核不育株系的育性变化差异,探讨低温敏核不育系的育性鉴定方法和技术标准,同时根据临界不育温度分析低温敏核不育水稻进行安全制种的适宜区域和时段以及高产繁殖区,旨在促进人们对低温敏核不育水稻育性变化规律的认识,促进低温敏核不育系在杂交水稻中的应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以G0543S与丰源B制备的近等基因系低温敏核不育水稻 D7S、D40S、D3-1S、D3S 和 D8S 为研究材料。

1.2 花粉碘化钾染色

将内、外稃去除后,在显微镜下对花药形态进行观察并拍照。在载玻片上滴1滴1%碘化钾溶液,将花药置于溶液中,捣碎,去除残渣,在显微镜下观察花粉染色情况并拍照记录。花粉可染率=可育花粉粒数/总花粉粒数×100%,每个材料取3个视野的平均值[9]。

1.3 安全制种与高产繁殖安全率统计

挑选各省有代表性的地区,统计2011年到2019年的气象资料,计算逐日小于某温度临界值的保证率。计算公式为Pk=Nk/N×100%,Pk为小于等于临界温度k的保证率,N为资料的总年数,Nk为在N年中某日温度小于等于k℃年数[10]。

1.4 育性敏感期低温处理

不同低温敏核不育材料处理:根据实验前的育性观察,确定低温敏材料,然后将符合预期的材料(低温不育,高温可育)每个单株分4桶,自然条件下常规水肥管理。当水稻生长至育性转换敏感期前,将所有低温敏材料在自然光照,21℃、28℃、32℃、自然高温(33℃)下分别处理15 d。

1.5 统计学处理

2 结果与分析

2.1 不同低温敏核不育株系花药形态的比较

将不同低温敏核不育水稻分别在恒温21℃、28℃、32℃以及自然高温(33℃)条件下连续处理15 d,对其花药形态进行观察:在21℃条件下,花药瘦小,外观表现为白色或浅黄色,开花时无花粉散出(图1)；在28℃条件下,花药较瘦小,呈淡黄色,开花时除D8S有少量花粉散出外,其他不育系无花粉散出；在32℃和自然高温(33℃)条件下,花药较粗壮,表现为黄色,开花时有大量花粉散出。

图1 不同低温敏核不育株系的花药形态(标尺=2 mm)Fig.1 The anther morphology of different low temperature-sensitive genic male-sterile lines(Bars=2 mm)

2.2 不同低温敏核不育株系花粉育性的比较

低温敏核不育水稻发育至花粉母细胞期,分别在不同温度(恒温21℃、28℃、32℃以及自然高温33℃)处理15 d,抽穗开花期观察各材料育性变化规律,结果显示:21℃条件下,所有材料的花粉不育度达到99.9%以上,不育性稳定,花粉败育类型以典败为主,表明各材料均属于低温敏核不育水稻；28 ℃条件下,D7S、D40S、D3-1S、D3S 的花粉不育度均达到99.9%以上,不育性稳定,花粉败育类型以典败和圆败为主,表明以上材料不育起点温度高,而D8S可染花粉较高,部分花粉恢复了可育性,表明其不育起点温度低,不育性不稳定,安全制种时间和空间范围小；32℃条件下,D7S、D40S、D3-1S、D8S、D3S 的花粉可育度均在60%以上,表明此温度下这些材料能正常自交繁殖；自然高温33℃条件下,D3-1S的花粉可染率在60%以上,D7S、D40S、D8S的花粉可染率在60%以下,D3S的花粉可染率只有40%,表明D3-1S的临界可育温度高,其在高温条件下仍能正常繁殖,有利于不育系的高产繁殖；D7S、D40S、D8S、D3S的临界可育温度较低,在高温条件下自交繁殖能力较弱(图2)。

图2 不同温度下几种低温敏核不育株系的花粉育性比较(A)花粉育性观察(标尺=100 μm)；(B)21℃、28℃条件下花粉可染率统计；(C)32℃、33℃条件下花粉可染率统计。**表示与 D7S相比，P≤0.01。Fig.2 Comparison of the pollen fertility of several low temperature-sensitive nuclear male-sterile lines at different temperatures(A)Observation of pollen fertility,bars=100 μm；(B)Statistics of pollen dyeing rate at 21 ℃ and 28 ℃；(C)Statistics of pollen dyeing rate at 32℃and 33℃.**represents P≤0.01.

2.3 高温条件下不同低温敏核不育株系结实率的比较

在高温条件下,不同低温敏核不育株系的结实率差异明显。在恒定水温32℃条件下,D3-1S、D8S、D3S的结实率达60%以上,表明这些材料在32℃条件下能进行正常繁殖,D7S、D40S的结实率在35%以下,表明在此温度下这两个株系的繁殖产量低；在自然高温33℃条件下,D3-1S的结实率在60%以上,D8S的结实率在45%左右,D7S、D40S、D3S的结实率均在 35%以下,表明D3-1S耐高温,不育系的繁殖易获得高产。D8S、D7S、D40S、D3S对高温敏感,不利于不育系种子的高产繁殖(图3)。

图3 高温条件下不同低温敏核不育株系的结实率(A)穗子表型(标尺=3 cm)；(B)结实率统计。**表示与D7S相比,P≤0.01。Fig.3 Seed setting rates of different low temperature-sensitive male-sterile lines under high temperature conditions(A)Spike phenotypes；(B)Statistics of seed setting rates.Bars=3 cm；**represents P≤0.01.

本研究结果表明,不同低温敏核不育系完全不育的临界温度和高温繁殖条件下的耐高温特性存在显著差异。花粉完全不育的临界温度越高,杂交制种的安全性越高,但繁殖不育系的适宜温度区间小。为了提高不育系用于制种的安全性和不育自交可繁性,特在28℃条件下处理15 d以鉴定其不育性的稳定性,在32℃条件下处理15 d以鉴定其不育性高温繁殖不育系的稳定性。在此基础上,提出了低温敏核不育水稻双高的鉴定标准,即花粉不育的临界温度高(≥28℃),高温(≥32℃水温或自然日均温32℃)条件下结实率高(≥60%)。根据该双高标准,D3-1S为双高低温敏核不育系。

2.4 低温敏核不育系安全制种区域分析

选择适宜的时间和空间是确保利用低温敏核不育系进行杂交制种的关键。低温敏核不育系安全制种的温度区间为20～28℃,按照不出现连续6 d日均温超过28℃,此后10 d内不出现连续3 d日均温低于19℃的温度标准,确定低温敏核不育系的安全制种区域和安全期时段,将制种安全率为100%的区域划分为安全区,安全率在90%～99%之间的区域划分为风险区,安全率在90%以下的区域为不宜制种区。

东北三省是我国重要的粮食生产基地,水稻种植面积广[11]。且东北三省位于我国北部地区,具有冬季寒冷、夏季温暖的气候特征[12],日均温较低,水稻种植主要以耐冷性较强的粳稻为主。

经气象资料统计,黑龙江省是东北三省中低温(≤20℃)出现频率最高的省份,大兴安岭地区、黑河、齐齐哈尔、大庆由于低温出现频率较高而不适于水稻制种。对其他地区分析发现,各地7、8月份日均温大多在20～28℃之间。伊春和佳木斯在地理位置上处于黑龙江的北部,出现低温的频率较高,为杂交制种有风险区,适宜耐低温的低温敏核不育系进行安全制种。绥化、牡丹江、鹤岗等7个地区7月中旬至8月中旬没有诱导低温敏核不育系可育的高温,8月下旬没有影响杂交种子发育的低温,为制种安全区(表1)。

吉林省西部地区属于盐碱地且水资源缺乏,东部属于山区和半山区,水稻种植大部分在中部地区[13]。通过对中部地区5个城市的日均温进行分析,发现其均属于制种安全区,不育系育性和种子发育安全时段为7月下旬至8月下旬(表1)。

辽宁省位于东北三省的南部,在7月底8月初大概率出现日均温高于临界不育温度(≥28℃),从而导致安全制种时间分成两段,分别是6月中旬至7月下旬和8月上旬至8月下旬,为期近两个月。其中锦州低温出现频率较高,属于制种风险区,不育系育性和种子发育安全时段为8月初至8月底,为期25 d左右；丹东、大连等6个地区属于制种安全区(表1)。东北三省由北往南的安全制种不论在时间上还是在空间上都有所扩大。

表1 低温敏核不育系在东北三省的安全制种区(20～28℃)Table 1 Safety seed-producing areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in the three northeast provinces(20～28 ℃)

长江中下游地区包括六省一市,属于亚热带季风气候,夏季高温多雨,冬季寒冷少雨[14～15],是我国重要的水稻种植区。按照安全制种日均温为20～28℃的指标分析,江苏省的无锡、淮安、盐城、连云港等地区均有安全制种时段,即9月初至9月中旬,但要注意低温对水稻成熟的影响。湖北省除黄石和咸宁属于风险区外,其他地区由于高低温交错频繁出现,不适宜低温敏核不育系制种。安徽省和浙江省的北部地区属于风险区,制种时间可安排在9月上旬至9月下旬。其他各地区均不适宜低温敏核不育水稻制种(表2)。

表2 低温敏核不育系在长江中下游地区的安全制种区(20～28℃)Table 2 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in the Yangtze River’s middle and lower reaches(20～28 ℃)

云南省位于我国西南地区,属山地高原地形,为亚热带和热带季风气候[16]。通过对日均温进行分析发现,保山、临沧、楚雄、玉溪、文山等地具有日均温为20～28℃的时段,不育系育性敏感期安排在7月初至8月中旬,为杂交制种安全期；其中保山和临沧从6月底至9月初都为安全期,是最佳的安全制种区。德宏、昆明、曲靖地区,由于低温出现的频率高,适于耐低温不育系杂交制种。丽江和昭通地区偏北,因温度过低不适合安排制种(表 3)。

表3 低温敏核不育系在云南省的安全制种区(20～28℃)Table 3 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in Yunnan Province(20～28 ℃)

2.5 海南省低温敏核不育系安全制种区与高产繁殖区分析

海南省位于中国南端,属于热带海洋气候,气温较高,降雨量多[17]。水稻种植主要以籼稻为主。位于海南省北部的城市,如海口、琼海、临高、屯昌、定安、澄迈,在3、4月份低温出现频率高,安全率为90%～99%,属于制种风险区。三亚和陵水位于海南省的南部,是我国水稻南繁育种的主要基地,3月中旬至4月底的日均温在20～28℃,是安全制种时间段(表4)。

表4 低温敏核不育系在海南省的安全制种区(20～28℃)Table 4 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in Hainan Province(20～28 ℃)

海南省日最高温连续3天高于35℃的频率较低,5月下旬到6月中旬光热条件充足,日均温在31℃左右,此时安排低温敏核不育水稻繁殖,能有效保证不育系产量,但是也要注意夏季降雨量多和台风对水稻成熟期的影响。

3 讨论

杂交水稻的成功研制及逐步推广,使得我国水稻产量大幅度提升,在一定程度上解决了我国的粮食危机[18]。杂交育种从三系到两系的发展,标志着我国杂交育种技术逐渐成熟。但两系法中的光温敏核不育系的育性易受环境因素影响,所以存在育性不稳定的现象[19～20],因此一方面要选育临界不育温度低的光温敏核不育系,另一方面要选育一批新型水稻种质资源。

低温敏核不育系是一类具有低温不育、高温可育育性转换特点的杂交水稻育种资源,但是由于目前的研究较少,其推广应用面积不大。温敏核不育系“双低”标准的制定,能有效解决盛夏低温天气两用不育系育性反复的问题[21]。对于低温敏核不育水稻而言,临界不育温度越高,适宜安全制种的时间和地域也会更广；临界可育温度越高,耐高温能力越强,不育系繁殖产量更有保障。本研究以近等基因系低温敏核不育水稻为材料,在2018年夏天经过低温21℃处理15 d,筛选得到 5 个完全不育的材料:D7S、D40S、D3-1S、D8S、D3S；在2019年夏天分别设立21℃恒温水池验证其不育性,28℃恒温水池筛选临界不育温度高的材料,32℃恒温水池验证其自身繁殖能力,并于自然高温条件(33℃)下筛选临界可育温度高的材料,最终建立了“双高”低温敏核不育系的鉴定标准,即花粉不育的临界温度高(≥28℃),高温(≥32℃水温或自然日均温32℃)条件下结实率高(≥60%)。根据该双高标准,D3-1S为双高低温敏核不育系。该双高鉴定标准的建立和双高低温敏核不育系D3-1S的育成,将促进低温敏核不育系的研究和应用。

目前,关于低温敏核不育系的安全制种区和高产繁殖区的研究报道较少,本研究根据2011—2019年的气象资料进行分析,初步确定了一些地区的安全制种区和高产繁殖区:在东北三省,不育系潜在种植面积广阔,花粉育性安全期在7月中旬至8月中旬,这与王秀芬等[21]研究的东三省水稻生长时间相吻合；海南省不育系种植的优势是气候条件,安全期在3月中旬至4月底,对于海南而言,水稻适宜生长季节在3、4月份[22]。再则,海南省5月下旬至6月中旬温度较高,光热条件充足,可安排低温敏核不育水稻繁殖。由于温敏核不育水稻在不适宜繁殖的季节一般可采用冷水灌溉技术进行繁殖[23～24],所以对于低温敏核不育水稻可利用温度较高的温泉水繁殖不育系。基于云南省独特的地势和温度,安全制种时间可安排在7月初至8月中旬,且此时间段与云南省水稻种植生育阶段一致[25]；长江中下游地区虽然杂交稻的种植面积广,但由于各月份温度不稳定,高温和低温变化频繁,没有安全制种和高产繁殖不育系的时空。对于东北三省而言,由于温度较低,所以需要尽快选育出一批粳型低温敏核不育系,以适应当地温度,增大不育系在寒地地区制种的成功率。对于其他地区,需提高低温敏核不育系品种的多样性,使不育系的遗传背景更加丰富,提高杂交制种的安全性,增加不育系的繁殖产量。