痛风性关节炎发病的炎性机制研究进展

潘显阳 综述 陶金辉，李向培 审校

痛风是一种好发于男性的与高尿酸血症相关的以反复发作的急性关节炎为特征的炎性疾病。在发达国家成年人的患病率为1%～2%。由于人体尿酸生成过多和(或)排泄减少，体内血尿酸水平持续升高，导致针状尿酸盐结晶沉积在关节及周围组织和其他器官中引起炎症反应。痛风关节炎急性期主要表现为关节红肿热痛与功能障碍，慢性痛风长期反复发作可导致关节畸形以及痛风性肾病。单钠尿酸盐(monosodium urate, MSU)结晶是痛风的致病因子。多项研究表明MSU结晶可以激活多种免疫细胞释放白介素1 β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及其他炎症介质。其中IL-1β是诱导急性痛风性关节炎的主要介质。但研究表明高尿酸血症患者仅有10%左右发展为急性痛风性关节炎，提示除MSU以外还有其他复杂因素参与了疾病的发生。最近研究表明多种炎性细胞及相关信号通路参与了急性痛风性关节炎的发病机制。尤其是P2X嘌呤能受体配体门控离子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7，P2X7R)与ATP信号通路等多种因素参与了IL-1β分泌的调节。该文对近年痛风发病的免疫炎性机制研究进展进行一综述。

1 急性痛风性关节炎的免疫活性细胞的变化趋势

痛风急性发作是MSU晶体与局部机体组织间发生相互作用的结果，涉及的机制有固有免疫应答和适应性免疫应答机制，固有免疫反应是机体对病原体或损伤的第一道防线，包括巨噬细胞、树突细胞、组织细胞、枯否细胞和肥大细胞在内的一些固有免疫细胞，其表面的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)激活固有免疫反应。适应性免疫反应是由T细胞、B细胞介导的特异性免疫反应。炎症早期固有免疫细胞在启动炎症和诱导炎性反应发挥主要作用，近期研究表明巨噬细胞活化、中性粒细胞的募集以及调节性T细胞(regulatory cells，Treg)/辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)在痛风发病过程中的动态变化趋势可能参与痛风的炎症发病机制。

1.1 巨噬细胞活化与IL-1β过量表达对中性粒细胞募集的影响

既往多个研究表明，在痛风发病部位巨噬细胞活化、中性粒细胞的募集是急性痛风性关节炎的特征之一。Hall et al最新的研究表明，利用受精后第二天的斑马鱼幼体，将MSU注入其后脑室中并进行实时成像，可以检测到注射部位巨噬细胞和中性粒细胞大量表达，在注射后6 h达到高峰(IL-1β、TNF-α在注射后3 h达到高峰)，为了证实该反应并非巨噬细胞非特异性的活化，采用同样的方法注射可溶性尿酸和焦磷酸盐注入斑马鱼幼体后脑室中，可溶性尿酸未引起IL-1β、TNF-α表达变化，仅有焦磷酸盐可以使IL-1β、TNF-α表达增加，但表达水平与MSU诱导的产生存在差异。为进一步证实巨噬细胞是驱动促炎因子产生和中性粒细胞募集的主要细胞，使用转基因细胞系或注射氯磷酸脂质体耗尽斑马鱼幼体内的巨噬细胞，之后再注入MSU可以检测到IL-1β的表达减少、中性粒细胞募集减少；用IL-1β、TNF-α的抑制剂对斑马鱼幼体进行处理，之后再注入MSU可以检测到中性粒细胞募集减少，并且上述方法均不影响斑马鱼幼体内中性粒细胞的总数目。用吲哚美辛或秋水仙碱进行处理时均可以抑制MSU驱动的中性粒细胞募集，但不影响中性粒细胞的总数目。

有研究表明痛风的急性发作可能与血清脂肪酸水平的升高有关，此外脂肪酸可以增加人外周血单个核细胞/小鼠巨噬细胞内MSU刺激的IL-1β分泌。为了研究脂肪酸是否作为协同因子参与了MSU诱导巨噬细胞驱动的急性痛风性炎症，使用斑马鱼幼体进行实时成像，提示巨噬细胞利用脂肪酸氧化促进线粒体活性氧(mitochondria-derived reactive oxygen species, mROS)的生成，这种MSU晶体刺激以及脂肪酸氧化mROS生成，依赖JAK2/STAT3驱动的线粒体酶编码的免疫应答基因1(immunoresponsive gene 1, Irg1)表达，通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞特异性IL-1β、TNF-α的生成，对中性粒细胞募集发挥重要作用。这种巨噬细胞活化的免疫炎症机制在人外周血的单核细胞系(THP-1单核/巨噬细胞)中同样发挥重要作用。

1.2 Treg/Th17细胞在痛风性关节炎急性发病时的变化趋势

CD4T细胞中的Th17细胞释放的IL-17可以通过诱导粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、趋化因子发挥募集中性粒细胞的作用。IL-1可诱导固有免疫细胞产生IL-6，刺激幼稚T细胞向Th17细胞分化，有研究报道IL-1β通过调控γδ T细胞分化，促进IL-17的生成。Tregs在固有免疫及适应性免疫中发挥重要作用，Tregs通过多种机制抑制促炎反应，包括产生免疫调节因子IL-10和TGF-β，抑制效应T细胞的增殖、树突状细胞共刺激分子CD80和CD86的表达等，而Tregs的缺失则与大多数自身免疫性疾病有关。Dai et al的研究表明MSU诱导的急性痛风性关节炎大鼠模型中，对血清中的细胞因子进行测定，血清IL-17在12 h内达到高峰，随之逐渐减少，对大鼠脾脏Treg/Th17细胞进行测定，结果显示Treg/Th17比值在整个过程中均低于正常对照组，当Treg/Th17比值达到最低水平时，踝关节肿胀最为严重，两者具有时间一致性，提示Treg/Th17细胞比值的失衡可能与急性痛风关节炎的发病机制有关。同时结果显示，相关细胞因子如IL-6可以使Treg/Th17细胞比例减低，加重炎症进展。IL-6作为协同因子与TGF-β共同调节T细胞，促进Th17细胞分化，同时IL-6可以抑制TGF-β诱导的Treg分化，提示IL-6的异常分泌可以导致Treg/Th17的值失衡。

2 激活痛风性关节炎发病的多种炎症信号通路

研究表明MSU结晶与固有免疫细胞间的相互作用可能通过不同机制激活多条炎症信号通路，主要包括TLRs信号通路、NLRs信号通路等。

2.1 TLRs介导的信号通路

固有免疫中，TLRs是一种重要的模式识别受体，最先在传染性病原菌的免疫应答中被发现。TLRs可以识别外源病原微生物并激活主要免疫应答，因此其在炎症细胞因子的产生和下游信号转导通路中发挥重要作用。TLRs属于跨膜受体，其氨基末端具有富含亮氨酸的重复单位(leucine rich repeat，LRR)，细胞内的羧基末端被称为Toll/IL-1受体结构域(toll-IL-1 receptor domain，TIR)。有4种衔接分子与TLRs发生相互作用，髓样分化因子MYD88、toll-IL-1 受体结构域衔接蛋白、TIR结构域衔接蛋白1和TIR结构域衔接蛋白2。将MSU注射入MYD88缺陷小鼠腹腔中，测得中性粒细胞浸润反应显著减少，在其余衔接分子缺陷小鼠中未观察到这种效应，提示急性痛风关节炎需要MYD88参与，而其他TIR衔接分子不参与该过程。

所有的TLRs和IL-1R具有共同的TIR结构域，将MSU分别注射入IL-1R、IL-18R缺陷小鼠的腹腔中，测得IL-1R缺陷小鼠的腹腔内中性粒细胞浸润反应大幅减少，提示IL-1的产生和IL-1R的激活在MSU诱导的炎症中发挥重要作用。体外实验表明，MSU与TLR配体(脂肪酸/脂多糖)结合，可以激活巨噬细胞表面的TLR2和(或)TLR4，刺激IL-1前体产生，并活化TLR，发挥募集MYD88的作用，通过TRAF6-TAK1(TNF受体相关因子6-活化转化因子β活化激酶1)信号通路进而诱导下游转录因子NF-κB激活，启动炎症级联反应，促进更多IL-1前体和中性粒细胞趋化因子、TNF-α等多种炎性细胞因子产生。Mylona et al的实验表明，对痛风患者和健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)单独使用MSU进行处理，不能诱导IL-1β、IL-6或TNF-α等细胞因子的产生，而在饱和脂肪酸C18∶0(硬脂酸)等TLR2配体物质的存在下，痛风患者相比健康对照组可以产生较多的IL-1β，MSU晶体和TLR-2配体之间的协同作用在痛风患者中比对照组更为明显，推测可能是由于痛风患者的NLRP3炎性小体更容易被激活。

2.2 NLRs信号通路

NALP3炎性小体是核苷酸结合寡聚结构域样受体家族成员NALP3、凋亡相关斑点样蛋白ASC、效应蛋白caspase-1等组成的蛋白复合体，多种细胞均可产生NALP3。NALP3炎性小体可以感受多种信号，如PAMPs和DAMPs都能通过激活NALP3活化caspase-1，对IL-1β前体和IL-18进行加工处理并释放成熟的IL-1β和IL-18。NALP3有多种活化信号通路：① 微生物毒素(如尼日尼亚菌素等)通过介导微孔结构改变，使K外流Ca内流活化NALP3炎性小体，有文献报道在该过程中IL-1β与钙调蛋白的相互作用对于IL-1β处理与释放起重要作用；② 一些研究也表明NALP3炎症小体的激活需要通过细胞外ATP门控的P2X7R与另一种类型的通道蛋白结合，即泛连接蛋白1。ATP门控的P2X7R非选择性阳离子通道活化，导致pannexin-1通道开放，K外流而Ca内流，激活NALP3炎性小体；③ 细胞直接吞噬微晶体(MSU或石棉、二氧化硅等)，激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶催化反应产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，诱导NALP3活化。或细胞吞噬大分子晶体物质失败，将其捕获在细胞表面时，也可引起K外流，诱导NALP3活化。有研究报道，在多种哺乳动物中均存在NALP3炎性小体中特殊位点间二硫键的形成，推测ROS可能通过调节NALP3炎性小体中二硫键的形成，发挥重要作用；④ 吞噬MSU结晶导致溶酶体肿胀和破坏可以作为细胞内的危险信号，引起K外流活化NALP3；有研究表明MSU诱导蛋白酶体自噬降解受损，激活NALP3，上调caspase-1活性，促进IL-1β增多；将细胞中NALP3炎性小体的任一组分进行阻断，之后无论使用MSU结晶或是微生物毒素对细胞进行处理，都可以观察到细胞分泌IL-1β的水平显著减少，提示NALP3炎性小体通路是IL-1β释放与急性痛风性关节炎发生发展中十分重要的通路。Marchetti et al的研究表明通过给予小鼠口服/腹腔灌胃NALP3抑制剂OLT1177时，可以减少痛风性关节炎小鼠模型中关节肿胀，减少滑膜组织中NALP3与IL-1β的表达，减少滑液中IL-1β的表达。许多研究表明细胞外ATP是激活NALP3炎症小体的危险信号，细胞外ATP与P2X7R的结合诱导了泛连接蛋白微孔的形成和K的流出，表明胞外ATP浓度的改变是激活NALP3炎症小体的重要信号。此外还有研究报道，MSU结晶或是微生物毒素引起K外流Ca内流后，通过抑制氧化磷酸化和糖酵解，导致细胞内ATP浓度的减少，也可以导致NALP3炎性小体的集聚并激活IL-1β的释放。

3 痛风性关节炎急性炎症缓解的分子机制的研究进展

在痛风急性发作过程中，即使没有治疗措施的干预，痛风也能在7～10 d内自行缓解，此过程也被称为痛风的“自限性”。目前对痛风自发性缓解机制的研究主要包括急性期尿酸排泄改变，凋亡细胞、炎症细胞的清除，中性粒细胞胞外诱捕网(NETS)的形成及细胞因子的调节等。

痛风急性发作时，不同患者的血尿酸水平具有明显差异，多数患者血尿酸升高，而部分患者的血尿酸却显著降低，同时尿尿酸的排泄增多，可能的机制包括转运蛋白ABCG2表达的上调。

抑制炎症的一个经典机制是凋亡细胞的清除和非炎症性吞噬。在MSU晶体诱导的炎症中，这与巨噬细胞、中性粒细胞清除凋亡中性粒细胞有关。谷氨酰胺转移酶2(transglutaminase 2，TG2)在体内作为受体促进巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞，当TG2不足时，将导致中性粒细胞募集和MSU晶体驱动的炎症反应增强。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在调控炎症和免疫反应中发挥着重要作用,巨噬细胞和中性粒细胞清除凋亡细胞与TGF-β1的产生高度相关，痛风患者滑液中可检测到高浓度TGF-β1，携带TGF-β1的869T/C突变的TT基因型痛风患者，体内TGF-β1产生受损的同时，急性痛风发作更为剧烈。在啮齿动物MSU诱导的炎症模型中给予外源性TGF-β1后，可观察到细胞募集显著减弱,而中和TGF-β1将导致中性粒细胞呼吸爆发加剧。TGF-β1通过促进单核细胞源性巨噬细胞吞噬凋亡细胞，控制炎症反应；MSU募集的单核细胞也表现出促进吞噬活性。MSU晶体诱导的早期炎症环境中下游凋亡炎性细胞的清除，可能间接地程序性中止急性痛风发作。

在炎症起始阶段，中性粒细胞吞噬MSU晶体，并通过NADPH氧化酶产生ROS，释放多种中性粒细胞趋化物。导致中性粒细胞大量募集并活化。体外实验表明，痛风患者滑液中以及外周血中性粒细胞可以自发产生NETs。巨噬细胞源性的IL-1β同样可以促进NETs产生，NETs产生并大量聚集最终形成中性粒细胞胞外诱捕网交联体，其含有高浓度的中性粒细胞蛋白酶，可以通过降解多种促炎细胞因子、终止更多白细胞的募集，限制炎症反应。

IL-37是IL-1家族中一个独特的成员，是炎症和免疫反应的天然抑制因子。免疫细胞和非免疫细胞在炎症刺激后产生前体IL-37。经caspase-1裂解后，成熟的IL-37转运到细胞核中，抑制促炎基因的转录。前体和成熟的IL-37也在胞外空间分泌，与细胞表面IL-18受体α(IL-18Rα)结合，募集IL-1R8形成复合物，抑制NF-kB、MAPK和激活Mer-PTEN-DOK通路，传递抗炎信号。有研究报道急性痛风患者PBMC中IL-37和TGF-β1升高。TGF-β在细胞内主要的信号效应器是Smad蛋白，由TGF-β受体结合配体磷酸化，磷酸化的Smad3转移到细胞核并影响基因转录。IL-37也通过细胞内机制转运到细胞核中，IL-37活动需要Smad3参与，IL-37b与磷酸化的Smad3共定位。因此,有可能是IL-37与Smad3 相互作用作为TGF-β效应的信号通路，该复合物发挥作用，减少MSU诱导的炎症中IL-1β、IL-6, TNF-α的产生。提示急性痛风患者体内IL-37的上调可能是炎症诱导抗炎反应的结果。

4 抑制炎症信号通路的临床应用新机制

痛风发作时P2X7受体的激活导致微管和肌动蛋白重组，通过细胞骨架重排和K流出最终导致IL-1β释放。研究表明秋水仙碱可以抑制P2X7受体激活后微孔的形成，秋水仙碱在被吸收入新生的微管时，可以结合游离的微管蛋白二聚体,破坏微管进一步聚合，微管聚合的破坏会抑制囊泡运输、迁移、分裂、细胞因子分泌和吞噬作用；高浓度的秋水仙碱也会引起微管裂解。秋水仙碱还可以抑制中性粒细胞胞内包括酪氨酸激酶和磷脂酶在内的信号分子、抑制趋化作用和吞噬作用过程中溶酶体酶的释放。最近的研究表明，秋水仙碱还能调节中性粒细胞的变形能力，抑制中性粒细胞的渗出。有研究显示，使用秋水仙碱处理ATP活化的多种细胞，可以减少其对阳离子染料的摄取；经ATP处理巨噬细胞，其分泌ROS的量明显增加，使用秋水仙碱处理后这些细胞产生ROS的量相比ATP处理细胞减少大约55%。这种抑制ROS形成的能力似乎特异地对ATP刺激导致的ROS生成有效，而其他诱导ROS产生的不同介质不被秋水仙碱抑制。单独使用秋水仙碱不影响ROS基础水平；有研究表明以微摩尔浓度的ATP对LPS预处理的巨噬细胞进行刺激，可以诱导其IL-1β的大量释放，而将这种细胞加用秋水仙碱处理，可以抑制其大约1/3的IL-1β生成。秋水仙碱对NALP3炎性小体多种通路，如ATP-P2X7R信号通路发挥作用，抑制NALP3炎性小体的激活，进而抑制IL-1β的生成和释放，减轻急性期炎症反应。

该文阐述了急性痛风发病机制中多种炎症细胞及细胞因子和信号通路的作用机制，有研究表明ATP在急性痛风性关节炎发病过程中起重要作用，然而其一些具体环节尚不完全明确，对上述机制的进一步探究，对痛风患者的新药物的研究具有重要意义。