角鲨烯通过调节细胞铁死亡减轻脑缺血再灌注损伤*

蒋 霞， 袁钰萍， 陈舒怀， 段名扬， 邓祖跃△

（1浙江工业大学绿色制药协同创新中心，浙江杭州 310014；2浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052）

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指脑组织在经历一段时间的缺血后，重新供血，被供血区组织产生大量的活性物质造成的脑组织损伤，这种损伤机制被认为与炎症反应、细胞凋亡和氧化应激等有关［1］。近期研究发现，铁离子代谢异常引起的细胞铁死亡可能是脑缺血再灌注损伤的重要病理生理机制［2］。

铁死亡（ferroptosis）是2012 年才提出的一种新型细胞死亡方式，是由铁代谢紊乱和脂质过氧化产物大量累积导致细胞死亡的一系列过程［2］。铁死亡与许多疾病密切相关，如肿瘤、神经退行性疾病、肾功能损伤和缺血再灌注损伤等［3］。Fang等［4］报道，在脑缺血再灌注损伤大鼠的损伤脑区观察到铁蓄积。Tou 等［5］在单侧短暂性大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中发现脑组织中有大量铁积累，而铁死亡抑制剂ferrostatin-1 治疗可以减少脑梗死体积，并改善MCAO 引起的行为缺陷。这些研究均表明，铁死亡与脑损伤密切相关。在寻找治疗缺血再灌注脑损伤的药物中，有研究者关注到了以铁死亡为靶点的药物。现在临床上主要是铁螯合剂、辅酶Q10 和补充硒（Se）等化学制剂，其应用均有一定的局限性，且可选品种比较少，为了更好防治铁死亡对缺血再灌注脑损伤的影响，有研究者开始寻找抗铁死亡的天然药物［6］。许璐等［7］报道，丹参酮ⅡA 可能通过抑制脂质氧化活性和铁含量达到抑制铁死亡和保护海马细胞的作用。Yu等［8］发现一种植物来源的单萜酚——香芹酚，可通过降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，减少铁沉积和升高谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的水平，即通过抑制铁死亡来抑制缺血再灌注损伤后海马神经元的损害并逆转神经功能缺陷。

角鲨烯（squalene，SQU）是深海环境中的大型鲨鱼肝脏中提取出的天然物质，是一种开链三萜类化合物。由6 个异戊二烯单位构成的三萜类化合物具有携氧、降胆固醇、抗氧化、抗辐射和解毒的作用，同时对免疫功能及肿瘤的预防和治疗也有一定的生理作用［9-10］，本实验室前期研究发现，SQU 能拮抗谷氨酸对脑的毒性损伤［11］。那么SQU 对CIRI 脑组织损伤是否有作用，目前还没有明确报道，本次实验的目的是证实角鲨烯对脑缺血再灌注损伤脑组织的保护作用，进一步了解角鲨烯调节CIRI 是否与铁死亡相关并探讨可能的机制，为角鲨烯的临床应用提供实验基础。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 药品、试剂和仪器 药用植物油（西安天正药用辅料有限公司）；角鲨烯胶丸（浙江海力生）；去铁敏（deferoxamine，DFO）；铁死亡诱导剂erastin、铁死亡的强效抑制剂铁抑素1（ferrostatin-1，Fer-1）为Selleck 产品；TTC 染液、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、组织铁测定试剂盒和ROS 测定试剂盒均购自南京建成；Ⅰ抗：GPX4、转铁蛋白受体（transferrin receptor 1，TFR1）和乙酰辅酶A 合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）购自Santa Cruz；SLC7A11、膜铁转运蛋白（ferroportin 1，FPN1）购自Abcam；GAPDH、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、青霉素/链霉素抗生素均购自碧云天；Ⅱ抗（Bioworld）；FeCl3、DMSO、MTT、DMEM 培养液、0.25%胰酶和磷酸盐缓冲液（PBS）均购自Gibco；新生牛血清（天杭生物）。Spectra Max190 酶标仪（Molecuar Devices）；AI6000 化学发光成像系统（GE）；RM2400型切片机、生物显微镜（Leica）；CO2培养箱（Thermo）等。

1.2 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，体质量180～200 g，清洁级，购自浙江省医学科学院实验动物中心［许可证号为SCXK（浙）2019-0002］。每天12 h光照（光照时间为8∶00～20∶00），自由饮食饮水，环境温度为20～22 ℃，相对湿度为75%，适应性饲养1周。

2 方法

2.1 大鼠CIRI 模型的建立 按参考文献［12］中的MCAO 方法稍改良建立大鼠CIRI模型，首先用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠（ip，3 mL/kg），于其颈部正中间切开，逐步剥离出颈部总动脉、颈外和颈内动脉，在颈部总动脉的远端剪一个0.4 mm 左右的V 型切口，从切口插入线栓入颈总动脉，然后不停调整角度，使线栓向前到达颈内动脉和大脑中动脉，固定线栓，制造缺血模型，120 min 后拔出线栓，实现再灌注，缝合。假手术组处理同于模型组手术，不插线栓。12 h 后，参照后面所列的Zea-Longa 改良后评分法对造模大鼠进行评分，得分在1～3 分的大鼠为造模成功大鼠，去掉造模不成功的大鼠，并用同一批次的合格模型补足数目。

2.2 动物分组与给药 60 只大鼠随机分为假手术（sham）组、MCAO 组、低、中、高剂量（20、40和80 mg·kg-1·d-1灌胃）SQU 处理组（MCAO+SQU-L、MCAO+SQU-M、MCAO+SQU-H 组）和MCAO+DFO（100 mg·kg-1·d-1腹腔注射）阳性组，每组10 只。在模型建立前3 d 开始给药，每天1 次灌胃给药，阳性组灌胃溶剂，假手术组和模型组腹腔注射0.9% NaCl；造模后给药7 d，最后1 d 进行行为学检查，处死动物，取脑组织冻于液氮备用。

2.3 大鼠神经行为学评分 再灌注12 h 和72 h 后，采用Longa改良评分法对大鼠神经行为学评分：无症状为0 分，无法伸展对侧前爪为1 分，大鼠向左侧转圈为2 分，行走时向偏瘫一侧倾斜为3 分，无自发活动或意识障碍为4分。

2.4 大鼠脑组织的TTC 染色 大鼠脑组织取下后，先放置于-20 ℃冰箱中冷冻至硬，行冠状切片，每片厚2 mm，切出5片，放置于2%TTC染液中，37 ℃避光孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定30 min后，拍照，采用Image-Pro plus 7.0 软件进行图像分析，计算大鼠脑部梗死灶体积。

2.5 FeCl3诱导的PC12 细胞损伤模型的建立及分组 将PC12 细胞（浙江工业大学药学院药理实验室赠予）以1×108/L 的密度接种于96 孔板，24 h 后吸去培养基。然后加入含200 μmol/L FeCl3的培养基，培养4 h，换培养基，建立铁死亡模型。细胞实验分组：空白对照（control）组、FeCl3（200 μmol/L）组、FeCl3+SQU（80 mg/L）组、FeCl3+erastin（5 μmol/L）组、Fe-Cl3+Fer-1（5 μmol/L）组、FeCl3+SQU+erastin 组、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 组和FeCl3+DFO（400 μmol/L）组，每组6个复孔，37 ℃，5%CO2孵育。加药24 h后于倒置显微镜下进行细胞形态学观察和存活率检测，收集各组细胞冻存备用。各组给药剂量参考了相关文献和前期预实验结果。

2.6 铁离子含量、ROS 荧光强度及GSH 和MDA 含量的检测 取脑缺血再灌注损伤大鼠梗死交界区组织/各组PC12细胞匀浆，按照试剂盒说明书步骤操作测定铁离子含量、ROS 荧光强度及GSH 和MDA含量。

2.7 细胞线粒体跨膜电位的检测 各组PC12 细胞在加药处理24 h后，吸去培养液，加入100 μL培养液和100 μL JC-1 染色工作液，混匀，37 ℃孵育20 min后用JC-1缓冲液洗涤2次，加入200 μL培养液，显微镜下观察并拍照。比较各组细胞的线粒体跨膜电位变化情况。

2.8 Western blot 法检测铁死亡相关蛋白的表达水平 取脑缺血再灌注损伤大鼠梗死交界区组织/各组PC12 细胞提取总蛋白，试剂盒蛋白定量后进行Western blot 检测：电泳、转膜、孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗，显色，以GAPDH 为内参照，应用图像分析软件Image J进行分析。

3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行处理，数据用均数±标准差（mean±SD）表示，数据进行单因素方差分析后，用SNK-q检验进行各组间均数的两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 SQU对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响

术后12 h 和72 h，与假手术组相比，MCAO 模型组大鼠的神经行为学评分增加（P＜0.05），提示该模型对大鼠的神经功能有明显的损伤。与模型组相比，SQU 各剂量和DFO 干预组的神经行为学评分均小于模型组，呈剂量依赖性，其中MCAO+SQU-H 和MCAO+DFO 组神经行为学评分较MCAO 组的差异具有统计学意义（P＜0.05），说明SQU 和DFO 均改善大鼠受损的神经功能。与术后12 h 相比，各组大鼠在72 h 的神经行为学评分都有所降低，说明大鼠有一定自愈能力，但各给药组的恢复更好，见表1。

表1 角鲨烯对脑缺血再灌注损伤大鼠MCAO 术后12 和72 h 神经行为学评分及脑组织铁含量、ROS 荧光强度、GSH 水平和MDA水平的影响Table 1. Effects of squalene（SQU）on neurobehavioral scores 12 and 72 h after MCAO，and iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury（Mean±SD）

2 角鲨烯对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响

假手术组没有梗死区，而模型组出现明显的脑梗死灶，梗死体积为（24.33±3.14）mm3，与假手术组相比显著升高（P＜0.01）；SQU 低、中、高剂量组和DFO 组的脑梗死体积分别为（20.68±2.13）mm3、（17.86±1.69） mm3、（7.42±1.49） mm3和（7.43±1.25）mm3，与MCAO 组比较，MCAO+SQU-M 组、MCAO+SQU-H 组和MCAO+DFO 组的梗死体积均降低（P＜0.05），而MCAO+SQU-L 组脑梗死体积有轻度降低，但较MCAO 组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

Figure 1. Effect of squalene（SQU）on infarct volume induced by cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs sham group；#P＜0.05vs model group.图1 角鲨烯对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响

3 角鲨烯对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化损伤相关指标的影响

与假手术组相比，MCAO 组损伤脑组织中铁离子含量、ROS 荧光强度和MDA 水平明显升高，GSH水平明显降低（P＜0.05）；与MCAO 组比较，SQU 各剂量组铁离子含量、ROS 荧光强度和MDA 水平逐渐降低，GSH 水平逐渐升高，基本呈浓度依赖性，MCAO+DFO组结果与MCAO+SQU-H组相接近，见表1。

4 角鲨烯对脑缺血再灌注损伤大鼠铁死亡相关蛋白表达的影响

与假手术组相比，MCAO 组脑组织中SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达降低，ACSL4 和TFR1 表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，MCAO+SQU 组和MCAO+DFO 组的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达出现不同程度的增加，ACSL4 和TFR1 的表达出现不同程度的降低，除MCAO+SQU-L 组的FPN1 的蛋白表达较模型组差异没有统计学意义外，其余组差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

Figure 2. Effects of squalene（SQU）on the expression of ferroptosis-related proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury.Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs sham group；#P＜0.05vs MCAO group.图2 角鲨烯对脑缺血再灌注损伤大鼠铁死亡相关蛋白表达的影响

5 角鲨烯对FeCl3诱导的PC12 细胞形态学和存活率影响

与空白对照组相比，FeCl3组的细胞数目显著减少，出现明显损伤，细胞存活率显著降低（P＜0.05）；与FeCl3组相比，FeCl3+erastin 组细胞损伤更严重，死亡细胞数目增加，细胞存活率进一步降低（P＜0.05），而FeCl3+SQU 组、FeCl3+Fer-1 组、FeCl3+DFO 组、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 组存活细胞数目增加（P＜0.05），Fe-Cl3+SQU+erastin 存活细胞数目稍有增加，但差异较FeCl3组没有统计学意义（P＞0.05）；与FeCl3+erastin组比较，FeCl3+SQU+erastin 存活细胞数目有所增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与FeCl3+Fer-1 组比较，FeCl3+SQU+Fer-1 组的存活细胞数目进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

Figure 3. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on morphological change and viability of PC12 cells induced by FeCl3. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.图3 角鲨烯与erastin和Fer-1联合用药对FeCl3诱导的PC12细胞形态和存活率的影响

6 角鲨烯对FeCl3诱导的PC12 细胞模型氧化损伤相关指标的影响

与空白对照组比较，FeCl3诱导的PC12细胞模型组铁离子含量、ROS荧光强度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05）；与FeCl3组比较，FeCl3+erastin 组的铁离子含量、ROS荧光强度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05），其余各组铁离子含量、ROS荧光强度和MDA 水平出现不同程度的降低，GSH 水平出现不同程度的升高，其中FeCl3+SQU+Fer-1 组变化最明显（P＜0.05）；与FeCl3+erastin 组比较，FeCl3+SQU+erastin 组铁离子含量、ROS 荧光强度和MDA 水平降低，GSH 水平升高（P＜0.05）；与FeCl3+Fer-1 组比较，FeCl3+SQU+Fer-1 组铁离子含量、ROS 荧光强度和MDA 水平进一步降低，GSH 水平进一步升高（P＜0.05），见表2。

表2 角鲨烯与erastin和Fer-1联合用药对FeCl3诱导的PC12细胞铁含量、ROS荧光强度、GSH水平和MDA水平的影响Table 2. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the PC12 cells induced by FeCl3（Mean±SD. n=3）

7 角鲨烯对FeCl3诱导的PC12 细胞线粒体跨膜电位的影响

与空白对照组相比，模型组的线粒体跨膜电位明显下降，说明FeCl3对PC12细胞的损伤可以显著降低线粒体跨膜电位；与FeCl3模型组相比，除FeCl3+erastin 组线粒体膜电位下降更为明显，其他组的线粒体膜电位均有不同程度的升高，说明SQU 和DFO的给药减轻了FeCl3诱导的PC12细胞的损伤，且铁死亡诱导剂erastin 的使用降低了SQU 的修复能力，而与抑制剂Fer-1 的联合用药对损伤恢复的效果更好，见图4。

Figure 4. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on mitochondrial transmembrane potential in PC12 cells induced by FeCl3（×200）.图4 角鲨烯与erastin、Fer-1联合用药对FeCl3诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响

8 角鲨烯对FeCl3诱导的PC12 细胞铁死亡相关蛋白表达的影响

在PC12 细胞实验中，与空白对照组相比，FeCl3模型组SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达水平降低，ACSL4和TFR1表达水平升高（P＜0.05）；与FeCl3模型组比较，FeCl3+SQU 组、FeCl3+DFO 组和FeCl3+Fer-1 组的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达水平升高，ACSL4 和TFR1 表达水平降低（P＜0.05），而FeCl3+erastin 组SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达水平降低，ACSL4 和TFR1 表达水平升高，除GPX4 和TFR1 蛋白外，其他蛋白的差异均有统计学意义（P＜0.05）；与FeCl3+erastin 组比较，FeCl3+SQU+erastin 组SLC7A11、GPX4和FPN1 表达水平升高，ACSL4 和TFR1 表达水平降低（P＜0.05）；与FeCl3+Fer-1 组比较，FeCl3+SQU+Fer-1 组SLC7A11、GPX4 和FPN1 表达水平进一步升高，ACSL4 和TFR1 表达水平进一步降低（P＜0.05），见图5。

Figure 5. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on the expression of ferroptosis-related proteins in the PC12 cells induced by FeCl3. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.图5 角鲨烯与erastin、Fer-1联合用药对FeCl3诱导的PC12细胞铁死亡相关蛋白表达的影响

讨论

本次实验结果显示，给予SQU 的大鼠与模型组大鼠比较，其神经行为学评分降低，梗死体积均减小，神经元细胞的损伤减轻，并存在剂量依耐性，说明SQU 对CIRI 大鼠脑组织有保护作用。有研究报道，因为CIRI 与脂质过氧化和细胞内高水平铁含量等铁死亡相关信号密切相关［13--14］，本次实验又设计了FeCl3诱导铁死亡细胞模型，进一步研究SQU 对CIRI 过程中铁死亡相关通路的影响，了解其可能的调控机制。

铁死亡涉及多条通路，其中包括铁代谢失调、脂质代谢异常和氧化损伤等，其过程为CIRI 改变脑内相关分子，导致了铁的负载，铁累积使细胞内不稳定铁池的铁含量升高，这些增加的二价铁通过Fenton反应产生羟基自由基和脂氧合酶途径催化脂质过氧化，导致氧化应激水平的增加；脂代谢增加膜磷脂上的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），使其易受ROS攻击导致脂质过氧化；当细胞无法通过抗氧化机制有效清除胞内ROS，导致脂质过氧化物质积累，从而使细胞死亡［2，15-18］。以铁和PUFAs 为原料推动了铁死亡的发生，同时以GSH 为底物的GPX4则反向调控铁死亡［2，15］。

在铁死亡相关的各通路中有各自的关键分子，铁代谢中TFR1蛋白与Fe3+进入细胞，而FPN1负责将细胞内多余的铁释放入细胞间隙［19］。脂质过氧化相关机制主要是Xc-/GPX4系统，系统Xc-是存在于膜表面的胱氨酸/半胱氨酸-谷氨酸的转运蛋白，其轻链亚基（SLC7A11）是活性指标，GPX4 是谷胱甘肽过氧化物酶系的一员，在保护细胞免受脂质过氧化、抑制铁死亡的过程中起着关键作用［20］，GSH与GPX4结合发挥清除脂质过氧化的作用，是铁死亡的特异性指标［21］。脂质代谢过程中，ACSL4 和溶血卵磷脂酰基转移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）通过调控不饱和脂肪酸（如花生四烯酸和肾上腺酸）的转化，改变膜磷脂的稳态，是脂肪酸代谢的关键因素［16，22］。本研究中，TFR1 表达增加，FPN1 表达降低，铁含量增加，产生大量ROS，SLC7A11 表达降低，谷氨酸半胱氨酸交换减少，使GSH 含量减少，进而使得GPX4 的活性下降，细胞清除脂质过氧化物能力不足，而ACSL4表达增加，增加了神经元膜磷脂的多不饱和脂肪酸的磷脂含量，使膜更易受到氧化攻击，产生了更多的氧化产物如MDA等，这些脂质过氧化累积在线粒体膜，使线粒体膜电位下降，发生细胞铁死亡，进而使神经功能受损。

许多天然产物对抑制细胞铁死亡有明显效果，如黄芩素、远志皂苷元［22-23］可抑制铁累积，降低脂质过氧化水平，抑制铁死亡。SQU 作为海洋生物鲨鱼肝脏的天然物，因其独特的结构而具备很多生理功能［24］。本研究结果显示，SQU 可以降低缺血再灌注损伤脑组织中铁离子含量，因为SQU 可以降低脑组织TFR1表达来降低铁的来源，增加FPN1表达，增加铁的排出，使细胞内不稳定铁池的铁含量降低；SQU抑制了氧自由基引起的脑突触体释放谷氨酸，改善脑损伤后胞外高谷氨酸浓度的微环境，从而减弱谷氨酸对天冬氨酸的刺激，导致天冬氨酸蛋白表达相应下调，进一步降低细胞的铁摄取。因为天冬氨酸受体刺激可通过TFR1 和二价金属转运蛋白1 诱导分子级联反应，导致神经元铁摄取增加［25-27］。本次实验在铁死亡细胞模型中给予SQU 也获得与动物实验相同的降低铁死亡的结果，另外，在细胞实验中，还增加了铁死亡诱导剂erastin，结果显示erastin增加了TFR1 的表达，加重了铁死亡模型细胞的死亡，但SQU 对TFR1 的抑制作用，减轻了erastin 加重的细胞铁死亡，证明了SQU对铁代谢的调控作用。

SQU 可使脑组织中脂肪酸代谢的关键分子ACSL4蛋白的表达水平下降，使易氧化损伤的膜磷脂减少，使膜的稳定性增加［28］，本次实验中也观察到SQU使铁死亡模型细胞的线粒体跨膜电位增加，细胞存活增加，但SQU 调节ACSL4 蛋白表达的具体机制还不清楚，将在下一步研究。

SQU 在细胞和动物实验中，表现出强的抗氧化能力，SLC7A11 和GPX4 表达水平上调、GSH 含量增加及MDA 水平降低，其机制可能与SQU 的化学结构类有似β-胡萝卜素的异戊间二烯化合物，含有多个不饱和烃，能结合多种自由基，发挥抗氧化作用有关［29］。SQU 上调SLC7A11 蛋白表达，增加了半胱氨酸的交换，有利于GSH 生成，从而上调了GPX4 的活性，促进毒性脂质过氧化氢转化为无毒脂醇的效率，降低MDA 含量，达到降低脂质过氧化水平，改善神经元损伤的作用［30］。本课题组在细胞实验中使用铁死亡拮抗剂Fer-1 发现，SQU 可和Fer-1 有相互促进的抗铁死亡作用，主要表现二者合用比单独用任意一种药物更能降低铁死亡模型细胞MDA 水平，增加线粒体跨膜电位，进一步增加细胞存活率。

本研究结果证实了SQU 对CIRI 大鼠脑组织有保护作用，而其保护作用与调控铁死亡相关的3 条通路（铁代谢、脂质代谢和氧化损伤）密切相关，具体表现为为降低细胞内铁含量，改善脂肪酸代谢，增加细胞抗氧化作用。