广东某医院2018—2020年临床分离菌耐药性分析

汤英贤 张 慈 温伟洪 李玉珍 陈凌娟 徐令清

广州医科大学附属第六医院//清远市人民医院 广东清远 511518

近年来，由于抗生素的广泛使用和不合理应用，细菌耐药问题已经成为全球公共健康领域的重大挑战[1]。及时了解近3年来特别新冠疫情时期我院临床常见检出菌的耐药性和变化趋势，为临床医师合理用药提供参考依据。现将2018—2020年临床分离细菌的耐药性监测数据进行统计分析，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 回顾性分析我院2018年1月—2020年12月临床分离株，不包括同一患者分离的重复株。剔除非无菌部位分离到的凝固酶阴性葡萄球菌和草绿色链球菌。

1.1.2 培养基 哥伦比亚血琼脂、嗜血杆菌巧克力琼脂、麦康凯琼脂、MH琼脂、HTM琼脂均为郑州安图公司产品。

1.1.3 药敏纸片为英国OXOID公司产品；E试验条为浙江温州康泰生物科技有限公司产品。

1.1.4 仪器 采用美国BD公司phoenix M50全自动细菌鉴定药敏分析系统及其配套鉴定/药敏复合板及BD布鲁克基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定和药敏试验

常规细菌鉴定及药敏均采用phoenix M50进行；药敏结果参照2020年CLSI标准进行判读[2]。流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和淋病奈瑟菌等采用MALDI-TOF MS质谱仪进行鉴定，药敏试验采用纸片扩散法。万古霉素或利奈唑胺不敏感葡萄球菌或肠球菌,青霉素或美罗培南不敏感肺炎链球菌采用E-test法复核最低抑菌浓度(MIC)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853，金黄色葡萄球菌ATCC 29213,粪肠球菌ATCC 25912，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，肺炎链球菌ATCC49619，流感嗜血杆菌ATCC 49247。

1.2.2 β内酰胺酶检测 按CLSI推荐的酶抑制剂增强确证实验检测产ESBL菌株。

1.2.3 特殊耐药菌株定义 多重耐药指对三种及三种以上的抗菌药物耐药；碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)定义为对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任一种药物耐药者[3]。

1.2.4 数据统计分析 采用whonet 5.6软件。

2 结果

2.1 细菌种类及分布

2018—2020年共收集临床非重复菌株17 555株，2018年5 736株，2019年5 763株，2020年6 056株。门急诊和住院患者所分离菌株分别占7.8%和92.2%。革兰阳性菌4 604株，占26.2%；革兰阴性菌12 951株，占73.8%。革兰阳性菌检出率最高依次为金黄色葡萄球菌，肠球菌属和分离自血液、脑脊液等无菌体液标本的凝固酶阴性葡萄球菌。肠杆菌科细菌占分离菌的44.3%(7 780/17 555)，检出率最高的依次为大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。不发酵糖革兰阴性杆菌3 994株，占所分离病原菌的22.8%，其中检出率最高依次为铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌和卡他莫拉菌。主要菌株分布，见表1。菌株临床标本来源主要以呼吸道标本、尿液、伤口分泌物和血液为主，占78.17%。见表2。

表1 2018—2020年广州医科大学附属第六医院菌株分布

表2 17 555株分离菌在各类临床标本中的分布 (n,%)

2.2 革兰阳性球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率

2.2.1 葡萄球菌属 共检出金黄色葡萄球菌1 661株，凝固酶阴性葡萄球(分离自血液、脑脊液、胸腹水等无菌体液标本)524株，其中MRSA和MRCNS分别占各自菌种的37.3%(620/1 661)和74.6%(391/524)。见表3。

表3 葡萄球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率

2.2.2 肠球菌属 1 109株肠球菌属细菌中粪肠球菌741株，占66.8%(741/1 109);屎肠球菌300株,占27.1%(300/1 109);其他肠球菌68株，占6.1%(68/11 109)。除万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺均保持较低耐药率外，屎肠球菌对喹诺酮类、β-内酰胺类和大环内酯类抗生素耐药性均显著高于粪肠球菌。未发现对万古霉素耐药粪肠球菌，1株对万古霉素耐药屎肠球菌经E试验确认MIC为64 mg/L，1株屎肠球菌对利奈唑胺耐药。屎肠球菌和粪肠球菌对各类抗菌药物的敏感率和耐药率见表4。

表4 肠球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率

2.2.3 链球菌属 1 238株链球菌属中肺炎链球菌396株，占49.2%。肺炎链球菌中2株分离自成人脑脊液。非脑膜炎肺炎链球菌儿童和成人分离株各占60.2%(237/394)和39.8%(157/394)，青霉素耐药者对所测试药物耐药率大部分大于青霉素敏感者。肺炎链球菌对复方新诺明和红霉素耐药率比较高，未发现对利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。见表5。

表5 儿童和成人患者非脑膜炎肺炎链球菌的耐药率

2.3 革兰阴性杆菌对抗菌药物的敏感率和耐药率

2.3.1 肠杆菌科细菌 大肠埃希菌和克雷伯菌属中产ESBL的检出率分别为46.9%(2014/4 292)和30.2%(600/1 989)。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类和阿米卡星的耐药率最低(≤3.9%)；产EBBL株对所测抗菌药物的耐药率均显著高于非产ESBL株。沙门菌属174株，均为非伤寒沙门菌；沙门菌属对氨苄西林的耐药率大于70%，对其余所测抗菌药物均较敏感。3年中未分离到志贺菌属。耐碳青霉烯类的大肠埃希菌检出率为0.6%(23/4 292)，散在分布于泌尿外科、神经外科、ICU病房和胃肠外科等16个病房，标本来源为尿液(39.1%)、呼吸道标本(21.7%)和血液(13.0%)。耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌检出率为3.5%(59/1 698)，主要来自于ICU病房(50.8%)、神经外科和康复医学科各(5.1%)，标本来源为呼吸道标本(55.9%)、尿液和血液标本均为(8.5%)。见表6。

表6 肠杆菌科细菌对抗菌药物的敏感率和耐药率

2.3.2 不发酵糖革兰阴性杆菌3 994株不发酵糖革兰阴性杆菌中，铜绿假单胞菌占37.7%，鲍曼不动杆菌占37.5%。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率为11.4%，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率为75.2%，嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明、左氧氟沙星的耐药率<11.0%，洋葱伯克霍尔德菌对头孢他啶、左氧氟沙星和复方新诺明的耐药率<10.0%。见表7。

表7 不发酵糖革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率

2.3.3 流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌89株(13.0%)分离自成人，595株(87.0%)分离自儿童。β内酰胺酶的检出率为46.2%；对氨苄西林的耐药率为59.5%。流感嗜血杆菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率相对较高。见表8。

表8 流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率

3 讨论

本监测结果显示，2018—2020年该院临床分离非重复菌共17 555株，其中革兰阳性菌占26.2%，革兰阴性菌占73.8%，与全国细菌耐药监测网监测数据基本一致[4-5]。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌通常被认为既可引起医院感染和社区感染，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌主要引起医院感染[6]，本院分离菌居前5位的分别为大肠埃希菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌、不动杆菌属和铜绿假单胞菌，共占62.5%，与CHINET报道相。淋病奈瑟菌感染数于2020年快速增长，应该引起相关部门的重视。菌株临床标本来源主要以呼吸道标本、尿液、伤口分泌物和血液为主。标本来源构成比与曾雪花[7]所报道有较大差异，可能与我院多次向临床宣教，鼓励多送检无菌体液标本有关。

2018—2020年MRSA检出率分别为38.5%、41.1%和32.9%，均略高于同期CHINET监测网[4-5]的监测数据，MRSA和MRCNS对所测试抗菌药物的耐药率大都显著高于MSSA和MSCNS。未检出万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌，表明利奈唑胺、替考拉宁和万古霉素仍是治疗MRSA的有效药物[8]。

凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)检出率为3.0%，血液来源CNS占43.1%(226/524)，分离率前三位科室分别为ICU、儿科和新生儿科，该类菌常为血培养污染菌，也是导管相关性血流感染的常见菌，当机体免疫力低下或进行侵袭性操作时，也可能导致菌血症[9]。针对前期临床血培养送检率低，且凝固酶阴性葡萄球菌属无法确切区分污染菌或致病菌，通过多途径加强检验与临床沟通，增加血培养双瓶双套送检率，规范血培养标本的采集等，有助于帮助临床正确区分CNS为污染菌或致病菌，从而减少抗生素的不合理使用。

肠球菌属中粪肠球菌的检出率高于屎肠球菌，除万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺外，屎肠球菌对其他所检测抗菌药物耐药性均显著高于粪肠球菌，与曹辉等的报道一致[10]。检出万古霉素耐药粪肠球菌和屎肠球菌各一株，分别分离自尿标本和血培养；3株利奈唑胺耐药肠球菌属，均采用E试验对其进行复检，耐药基因检测有待进一步研究。利奈唑胺(LZD)是第一种应用于临床的噁唑烷酮类抗生素，一度被认为很难对其耐药，但由于LZD在临床上的广泛使用，其耐药问题也逐渐出现，不断有关于LZD耐药肠球菌的报道，多发生在暴露于利奈唑胺治疗以及延长疗程的患者中[11]。

609株肺炎链球菌中1株分离自ICU患者脑脊液标本，肺炎链球菌对复方新诺明和红霉素耐药率比较高，未发现对利奈唑胺和万古霉素耐药菌株。

肠杆菌科细菌大部分为条件致病菌，是医院感染和社区感染重要病原体，可导致化脓性疾病、肺炎、脑膜炎、败血症以及伤口、泌尿道和肠道感染。本次监测结果显示，大肠埃希菌、克雷伯菌属和阴沟肠杆菌ESBL的检出率分别为46.9%、30.2%和28.7%。数据显示三年间，ESBL+大肠埃希菌基本稳定，克雷伯菌属和阴沟肠杆菌呈下降趋势，CRKPN检出率有所上升；ESBL+和碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌检出率均低于同期CHINET监测结果[4-5]，可能与医院采取多环节管理措施对抗菌药物的使用进行管理有关。产ESBL株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、甲氧苄啶磺胺甲唑的耐药率均显著高于非产ESBL株，与陈培培等[12]的报道一致。肠杆菌科细菌对阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦仍保持较高敏感性，敏感率明显高于其他抗菌药物，可作为肠杆菌科细菌感染的首选药物。克雷伯菌属ESBL的检出率均低于大肠埃希菌，但对碳青霉烯类抗菌药物耐药率却远高于大肠埃希菌。

CRE菌株对常用抗菌药物高度耐药，对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林的敏感率均小于10%。3年间CRE检出率最高的科室分别为：ICU(34.4%)、泌尿外科(12.8%)和神经外科(10.4%)，CRE的检出以痰液和尿液为主，分别占38.9%和20.6%。据报道，CRE菌株耐药的机制包括产碳青霉烯酶，外膜蛋白缺失合并高产AmpC酶或ESBL，外排泵的过度表达[13]，其中最重要的机制是产碳青霉烯酶[11]。碳青霉烯类抗菌药物曾是治疗多重耐药肠杆菌科细菌最有效、最可靠的药物，随着耐药菌株的出现并呈上升趋势，已成为当前临床抗感染治疗的难题[14]。有研究显示，CRE菌株对多粘菌素、替加环素、磷霉素和阿米卡星有良好的抗菌活性，推荐上述抗菌药物联合治疗，可采用的给药方案如黏菌素或阿米卡星联合碳青霉烯类，黏菌素联合替加环素，阿米卡星联合磷霉素等，但不推荐多黏菌素与阿米卡星的联合[15。CRE总体检出率与本课题组前期报道[16]有所下降，可能与医院加强感染CRE患者的感染防控，严格执行标准预防措施有关。

不发酵糖革兰阴性杆菌以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为主，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌检出率远低于同时期CHINET监测结果；而耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌与同时期CHINET监测结果接近。铜绿假单胞菌对所检测抗菌药物耐药率较低，鲍曼不动杆菌对所检测抗菌药物耐药率均大于50%。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要分离自ICU(77.6%)、神经外科(9.9%)和呼吸内科(4.0%)，所送检标本主要为深部痰、肺泡灌洗液及支气管镜刷检物等。ICU分离率高可能因为ICU患者病情较重、住院时间长、大剂量使用广谱抗生素和各种侵袭性操作引起的医院获得性感染有关；鲍曼不动杆菌医院感染主要传播途径为接触传播，病例资料示神经外科和呼吸内科检出者多有同一时期入住ICU病史，可能为入住ICU期间感染，确证有待下一步分子分型行同源性检测。手卫生、环境的清洁、患者的隔离仍是医院感染控制的基础[17]。目前，对于鲍曼不动杆菌医院获得性肺炎或呼吸机相关性肺炎治疗疗程缺乏明确的规范，应重点参考临床病情的改善而非细菌学的清除，有学者推荐疗程不小于2周[18]。联合多粘菌素治疗鲍曼不动杆菌是主要的治疗方案，但治疗效果不佳，亟需新型抗菌药物的研发[19]。嗜麦芽窄食单胞菌对多种抗菌药物天然耐药，耐药机制复杂[20]，临床用药可选择较少。数据显示复方新诺明、左氧氟沙星对嗜麦芽窄食单胞菌有较高的敏感性，可作为本地区该菌抗感染的首选药物。

流感嗜血杆菌是社区获得性肺炎的重要病原体之一，氨苄西林一直以来作为治疗流感嗜血杆菌的首选药物，但随着β-内酰胺类抗生素的广泛使用，对氨苄西林的耐药率也不断的产生[21]。2020年可能由于新冠疫情，人们外出戴口罩、保持安全社交距离和非必要的聚集，流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌检出数急剧减少。对于本地区而言，环丙沙星、美罗培南、头孢吡肟、头孢曲松、左氧氟沙星、亚胺培南六种抗生素尚未发现耐药株，提示这些药物可以作为本地区临床治疗的选择。

综上所述，面对日益严峻的细菌耐药性问题，特别是多重耐药菌株MRSA、CRKPN、CRABA的不断增长，医院应加强细菌耐药性监测工作，根据监测结果指导临床合理用药[22]；微生物检测人员也应加强自身业务能力和利用不断发展的新技术对微生物的耐药监测，及时、准确的把结果反馈临床。医院感染管理科应建立耐药监测大数据，借助分子检测技术为院内多重耐药菌的感染流行防控提供依据，同时医务人员强化无菌操作观念，实施接触隔离，加强手卫生，避免耐药菌株院内播散流行。