龙脷叶乙醇提取物止咳、祛痰、抗炎作用研究

黄桂琼 陈 洪 袁维蔚 姚志强 占娆娜 杨荃怀

广州中医药大学惠州医院 广东惠州 516001

慢性咳嗽是造成社区重大疾病负担的原因之一，流行病学调查表明，咳嗽是社区的常见症状，全球成人发病率为9.6%[1]。在我国，慢性咳嗽是患者寻求呼吸专科评估的最常见原因，咳嗽是初级保健咨询期间报告的最常见症状[2]。龙脷叶(Sauropus spatulifolius Beille)是大戟科守宫木属(Sauropus)植物，气微，味淡、微甘，具“润肺止咳，化痰定喘”的功效，常用于治疗急性咽喉炎、支气管炎、支气管哮喘、肺结核等呼吸道疾病[3]。龙脷叶作为广东地道药材，其良好的止咳化痰作用已得到临床实践证实。本项目对龙脷叶的止咳、祛痰、抗炎作用进行实验研究。

1 方法

1.1 实验药物试剂

本实验所用的龙脷叶为我院中药房药用龙脷叶，由广州致信药业有限公司提供；氨水购于广州市化学试剂厂，酚红购自天津光复精细化工研究所。

1.2 龙脷叶乙醇提取物制备

取干燥的龙脷叶粉碎成粗粉，置多功能提取罐中，用 90%乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇，干燥，得总浸膏。

1.3 实验动物

SPF级雄性KM小鼠及SPF级雄性SD大鼠购买于南方医科大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(粤)2016-0041。饲养在SPF级别IVC系统中，12H昼夜交替，室温控制在25 ℃，湿度40%～60%。

1.4 鼠氨水引咳模型

将昆明小鼠放入1 000 mL的大烧杯并罩住烧杯口，用超声喷雾器以中档风速向烧杯中通入200 mL/L氨水，喷雾15 s后关闭，观察并记录1 min内咳嗽次数(以腹肌收缩，同时张大嘴呼吸为小鼠咳嗽1 次)，以咳嗽次数为3～6次小鼠作为初筛合格小鼠进行实验。将小鼠分为：模型组(等体积溶剂)，龙脷叶低剂量组(3 g生药/kg)、龙脷叶中剂量组(6 g生药/kg)、龙脷叶高剂量组(12 g生药/kg)、阳性对照组(孟鲁司特钠，2 mg/kg)，10只每组。连续给药5天，末次给药30 min后，将小鼠放于大烧杯内，用氨气引咳15 s，以腹肌收缩、同时张嘴作为小鼠咳嗽的指标，同时观察小鼠咳嗽潜伏期以及2 min内咳嗽次数。

1.5 小鼠气管排泌酚红实验

末次给药30 min 后，小鼠经腹腔注射5% 酚红溶液0.1 mL/10 g，0.5 h 之后处死动物，剪取相同一段气管。放进装有2 mL生理盐水的试管中，同时加入0.1 mL的1 M氢氧化钠溶液，置于波长546 nm处，测吸光度值，检测酚红含量。

1.6 大鼠急性肺损伤模型

SD大鼠分为对照组(等体积溶剂)，模型组(等体积溶剂)，龙脷叶低剂量组(2.25 g生药/kg)、龙脷叶中剂量组(4.5 g生药/kg)、龙脷叶高剂量组(9g生药/kg)、阳性对照组(孟鲁司特钠，1.5 mg/kg)，10只每组。大鼠腹腔注射LPS(2.5 mg/kg)制作大鼠急性肺损伤模型。造模后24 h麻醉后处死大鼠。

1.7 Elisa检测TNF-α、IL-1β含量

处死大鼠，打开胸腔，结扎右侧肺部，近头端气管位置，将预冷PBS缓慢注入大鼠左侧肺泡内，然后缓慢抽出，重复3次，将收集的肺泡灌洗液离心取上清，-80 ℃保存。按照ELISA 试剂盒说明书检测各组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α的表达水平。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 龙脷叶乙醇提取物对氨水致小鼠咳嗽的影响

龙脷叶乙醇提取物对浓氨水致小鼠咳嗽实验结果如图1所示，与对照组相比，龙脷叶乙醇提取物低、中、高剂量组小鼠咳嗽潜伏期均延长，差异有统计学意义(P<0.05)。龙脷叶乙醇提取物低剂量组的咳嗽潜伏期小于阳性对照组，与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。龙脷叶乙醇提取物中、高剂量组咳嗽潜伏时间与阳性对照组相当，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，龙脷叶乙醇提取物低、中、高剂量组能显著减少2 min 内小鼠咳嗽次数，差异具有统计学意义(P<0.05)；龙脷叶乙醇提取物高剂量组的2 min 内小鼠咳嗽次数与阳性对照组相当，差异无统计学意义(P>0.05)。龙脷叶乙醇提取物中、低剂量组的2 min 内小鼠咳嗽次数大于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：咳嗽潜伏时间；B：咳嗽次数；*P<0.05与对照组比较，# P<0.05；与阳性对照组比较

2.2 龙脷叶乙醇提取物对小鼠酚红排泌量的影响

酚红排泌量实验结果如图2所示，与对照组相比，龙脷叶乙醇提取物的酚红排泌量增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。龙脷叶乙醇提取物低剂量组的酚红排泌量小于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。龙脷叶乙醇提取物中、高剂量组的酚红排泌量与阳性对照组相当，差异无统计学意义(P>0.05)。

*P<0.05与对照组比较，# P<0.05；与阳性对照组比较

2.3 龙脷叶乙醇提取物对TNF-α、IL-1β含量的影响

促炎因子TNF-α和IL-1β对于炎性反应的发生和发展具有重要影响。龙脷叶乙醇提取物TNF-α、IL-1β表达的影响如图3所示。与对照组比较，模型组大鼠TNF-α，IL-1β含量均明显增加(P<0.05)。与模型组比较，龙脷叶乙醇提取物剂量依赖性的抑制大鼠TNF-α，IL-1β的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。龙脷叶中、高剂量组的TNF-α，IL-1β的表达水平与阳性对照组相近，差异无统计学意义(P>0.05)。龙脷叶低剂量组的TNF-α，IL-1β的表达水平高于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

咳嗽是临床常见症状，由内源性或外源性刺激物刺激呼吸道黏膜，造成神经肽的释放，刺激感受器引起神经冲动，刺激咳嗽中枢，大脑皮质控制性失衡而产生[4]。慢性咳嗽是我国常见的健康问题，随着工业化和城市化进程的加快，慢性咳嗽的患病率仍在逐渐上升。呼吸道感染是引起咳嗽与咳痰的最常见病因，此外，环境和职业暴露、吸烟以及不健康的生活方式也会引起慢性咳嗽[5]。尽管咳嗽是机体一种重要的防御反射，可清除呼吸道异物，但频繁剧烈或长时间的咳嗽会给患者工作、生活带来严重影响[6]。正常支气管黏膜分泌少量黏液，使呼吸道黏膜保持湿润。当呼吸道发生炎症时，黏膜分泌增多，毛细血管壁通透性增加。炎性渗出物与黏液、吸入的尘埃及组织坏死物等混合而成痰液，随咳嗽动作排出体外[7]。

A：TNF-α含量；B：IL-1β含量；*P<0.05与对照组比较，# P<0.05；与阳性对照组比较

咳嗽治疗主要分为对因治疗与对症治疗[8]。对应治疗主要是对咳嗽的原发病进行针对性治疗，如急性上呼吸道感染、变异性哮喘、胃食管反流等。然而临床上部分患者的咳嗽并没有明显诱因，只能进行对症治疗。目前的镇咳药主要分为以可待因、吗啡为代表的中枢性镇咳药，通过直接抑制延髓咳嗽中枢而产生镇咳作用；以那可丁、苯丙哌林为代表的外周性镇咳药，通过抑制咳嗽发射弧中的感受器、传入神经、传出神经中的某个环节而产生镇咳作用。尽管这些药物在咳嗽的对症治疗中有效，但是药物依赖性等副作用限制了它们的长期应用[9]。

龙脷叶是广东传统道地药材，临床研究表明，以龙脷叶为主药的方剂，如千龙汤可用于治疗呼吸系统疾病[10]，岭南医家刘小虹自拟的三叶汤(龙脷叶+人参叶+枇杷叶)在治疗咳嗽、咽痒具有良好的临床疗效[11]；现代药理研究亦同时表明，龙脷叶具有抗炎作用[12-13]；药理学分析发现合金欢基丙酮和黄酮苷等有效成分可能是龙脷叶化痰止咳作用的物质基础[14]。本研究采用雾化吸入氨水咳嗽模型，探索不同剂量龙脷叶乙醇提取物对氨水诱导咳嗽的影响，结果显示龙脷叶具有止咳和祛痰的作用。在多种呼吸系统疾病的发病过程中，炎症细胞大量浸润，常常伴有大量的炎性介质因子[15]。肺泡巨噬细胞受到脂多糖等内源性刺激后，会首先诱导TNF-α的产生，TNF-α可以进而诱导IL-1β的释放，这些炎症因子参与引发炎症的级联反应，诱导炎性细胞浸润，加速肺损伤病理改变[16-17]，故监测这些促炎因子是评价药物是否缓解肺部炎症反应的常用手段。我们进一步研究发现龙脷叶能够降低TNF-α与IL-1β的表达水平，提示龙脷叶具有抗炎作用，这与既往研究的结果一致[12,18]。本研究比较龙脷叶与阳性对照孟鲁司特钠的差异。孟鲁司特钠是一种口服的白三烯受体拮抗剂，能特异性抑制气道中的半胱氨酰白三烯(CysLT1)受体，从而达到改善气道炎症，有效控制咳喘症状[19]。我们发现龙脷叶高剂量组与阳性对照的作用相近。这些结果提示龙脷叶具有止咳、祛痰、抗炎的作用，然而其作用机制还有待进一步深入研究。