山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析

贾海燕，李辰浩，宋瑶瑶，刘凤娟，焦成瑾，徐全乐

(1 陇东学院 生命科学与技术学院，甘肃庆阳 745000；2 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨陵 712100； 3 天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃天水 741000)

β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)在山黧豆(Lathyrussativus)中首次获得分离和鉴定[1]，并被发现广泛存在于三七(Panaxnotoginseng)、西洋参(Panaxquinquefolium)和人参(Panaxginseng)等物种[2-3]。研究表明，β-ODAP是传统中药材三七止血的活性成分，被命名为三七素(dencichine)[2]，并在神经保护、糖尿病及肾病防治等过程中发挥重要作用[3-8]。因而，β-ODAP生物合成的调控是山黧豆、三七等作物品质形成机理研究的重要内容。

β-ODAP的生物合成在山黧豆种子萌发期和成熟期形成2个显著高峰[9]。对萌发期种子的代谢组学和转录组学分析表明，β-ODAP的生物合成与硫代谢等基础代谢途径密切关联[10-12]。其中，β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，β-CAS)负责催化异噁唑-5-酮与半胱氨酸(Cys)反应生成β-异噁唑-5-酮-丙氨酸[β-(isoxazolin-5-on-2-yl)alanine，BIA]。BIA进一步通过两步反应生成β-ODAP[13-14]。

在拟南芥和大豆等物种中的研究表明，β-CAS隶属于磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)依赖的β基取代的丙氨酸合成酶家族(β-substituted alanine synthase，Bsas)，可形成二聚体，分子量范围为50～70 kD[15-16]。在山黧豆中，将LsCAS的PLP附着关键位点Lys突变后导致突变体酶活丧失[14,17]，说明LsCAS也是PLP依赖性蛋白酶。该蛋白可通过与丝氨酸乙酰基转移酶(serine acetyltransferase，SAT)互作起到β-ODAP生物合成调控分子开关的作用[14]。

植物硫代谢途径调控的一个典型特征是2个CS同源二聚体与2个SAT同源三聚体共同形成半胱氨酸调控复合物十聚体(cysteine regulatory complex，CRC)，并通过聚合/解聚状态调节CS 与SAT酶活[18-20]。为进一步研究LsCAS功能及聚合状态，本研究克隆了LsCAS基因的CDS序列，构建了pGEX2T-LsCAS原核表达载体，通过蛋白纯化和Western-blot分析进行了LsCAS功能验证，并利用分子排阻初步解析山黧豆LsCAS蛋白的聚合状态，深入了解LsCAS的功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用山黧豆(Lathyrussativus)种子为西北农林科技大学生命学院实验室保存。种子在含腐殖土、蛭石、珍珠岩(1∶1∶1)的混和基质中于23 ℃萌发6 d，取其根部提取RNA。GST亲和柱购自碧云天生物技术公司，GST标签抗体购自美国Affinity公司，大豆CS 抗体为美国农业部Hari Krishnan教授惠赠，牛凝血酶购自上海翊圣生物科技有限公司，10 kD超滤管等购自Millipore。

1.2 试验方法

1.2.1LsCAS基因克隆采用Invitrogen公司的总 RNA 提取试剂盒(Trizol法)提取山黧豆6 d龄幼苗的根部RNA，利用TaKaRa公司的反转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行反转录合成cDNA。采用50 μL反应体系进行PCR扩增，其中5×PrimeSTAR 缓冲液 10 μL，dNTP 混合液(2.5 mmol/L)4 μL，模板2 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL。PCR程序为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min 15 s，30个循环；最后72 ℃ 延伸5 min。引物序列为F(ATCACCTTCCTCAAGCGAACCTC)和R(CTC-GGAACTCGTGGAAGAAAT)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.2 原核表达载体构建利用EcoR I和BamH Ⅰ对pGEX2T载体进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后采用天根DNA纯化试剂盒(Tiangen)进行切胶回收，利用T4DNA连接酶(TaKaRa)和带有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的LsCAS片段连接。重组产物转化到DH5α后，经菌落PCR、双酶切和测序鉴定。

M. DL2000；1. RT-PCR图1 LsCAS基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplification result of LsCAS

1.2.3 LsCAS蛋白纯化将pGEX2T-LsCAS重组质粒利用KCM法转化入感受态BL21(DE3)中。挑取单克隆于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养12 h后；取2 mL菌液转接于200 mL含有Amp的LB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG，25 ℃培养10～12 h。收集菌体后用PBS缓冲液重悬，超声破碎后收集上清液。使用碧云天GST亲和柱(BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin)进行亲和层析，用PBS缓冲液平衡GST亲和柱并洗去未结合杂蛋白，用含有10 mmol/L GSH的GST洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。通过SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

1.2.4 Western-blot分析上述纯化蛋白使用12.5%的SDS-PAGE分离后，转移到NC 膜上，用GST标签抗体和大豆CS 抗体分别进行验证。

1.2.5 分子排阻将纯化的LsCAS用牛凝血酶切割GST标签，用10 kD超滤管浓缩至蛋白终浓度为3 mg/mL。取1 mL样品，使用AKTA蛋白纯化系统，Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶柱分析纯化的LsCAS分子量。检测条件为：柱温室温，流速0.5 mL/min，流动相0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，含200 mmol/L NaCl)，检测波长为280 nm和412 nm。

2 结果与分析

2.1 山黧豆LsCAS基因CDS序列克隆

利用RT-PCR从山黧豆萌发6 d的幼苗根部RNA中进行LsCAS基因CDS序列的特异性扩增。结果表明，PCR扩增产物在1 000 bp左右，与预期相符，且条带单一(图1)。PCR产物的测序结果与转录组数据序列完全一致，表明所获序列为β-腈基丙氨酸合成酶基因。LsCAS基因的CDS序列为1 035 bp，编码344个氨基酸。编码的蛋白质具有典型的CBS-like 蛋白功能结构域(Cystathionine beta-synthase，CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)，表明LsCAS基因克隆成功。

2.2 LsCAS表达载体构建

采用酶切连接法构建LsCAS基因的原核表达载体。经菌液PCR验证后(图2，A)，挑取阳性克隆进行质粒提取及EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切验证(图2，B)。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，重组质粒的电泳迁移率略小于pGEX2T空载体；重组质粒经双酶切后在5 kb和1 kb左右呈2条条带，其电泳迁移率分别与pGEX2T空载体和LsCAS基因扩增产物大小相当。这表明重组载体构建成功。经测序证实后，将其命名为pGEX2T-LsCAS。

2.3 LsCAS蛋白纯化

利用IPTG进行重组质粒诱导表达后，采用GST亲和层析法对LsCAS融合蛋白进行纯化。SDS-PAGE检测表明，所获融合蛋白条带单一，大小在64 kD左右，符合预期大小。进一步利用GST标签抗体和大豆CS抗体进行Western-blot分析，在诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带，说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白(图3)。

A. 菌液PCR验证：1-8. 菌落PCR； B. BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切验证：1. pGEX2T；2. pGEX2T-CAS；3. pGEX2T-CAS酶切产物；4. pGEX2T酶切产物；5. LsCAS基因PCR产物；M. DNA marker图2 重组质粒验证A. Colony PCR: 1-8. Colony PCR of randomly selected colonies； B. Double enzyme digestion by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ: 1. Plasmid pGEX2T; 2. Plasmid pGEX2T-LsCAS; 3. Enzyme digested fragments of pGEX2T-LsCAS; 4. Enzyme digested fragments of pGEX2T; 5. Cloned LsCAS gene via RT-PCR; M. DNA markerFig.2 Identification of recombinant plasmid

A. SDS-PAGE；B. 利用大豆CS抗体检测；C. 利用GST标签抗体进行检测；M.蛋白质分子量标准；1.IPTG诱导前总蛋白质；2.IPTG诱导后总蛋白质；3.纯化后的LsCAS蛋白图3 LsCAS蛋白纯化的 SDS-PAGE及Western-blot检测A. SDA-PAGE; B. CS antibody; C. GST antibody; M. Regular range protein marker; 1. Total protein before IPTG induction; 2. Total protein after IPTG induction; 3. The purified LsCASFig.3 SDA-PAGE and Western-blot analysis of purified LsCAS

2.4 分子排阻分析

使用Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶柱判断LsCAS在离体条件下的分子量。结果表明(图4)，纯化的LsCAS在412 nm下具有特征吸收峰。由于412 nm是磷酸吡哆醛PLP的特征吸收波长[21]，说明LsCAS属于PLP依赖的蛋白酶家族。在280 nm检测波长下，LsCAS在洗脱体积为14.56 mL处有最大吸收值。根据标准蛋白分子的排阻体积进行计算，对应的分子量为145 kD左右。由于LsCAS蛋白单体分子量为36 kD，说明LsCAS在离体条件下可能以四聚体方式存在。

图4 分子排阻验证LsCAS分子量及聚合方式Fig.4 Molecular weight analysis of LsCAS via size-exclusion chromatography

3 讨 论

在山黧豆中，LsCAS是β-ODAP生物合成途径的关键酶，负责催化异噁唑-5-酮与Cys合成关键中间化合物BIA[13-14]。研究表明，β-CAS隶属于磷酸吡哆醛PLP依赖的半胱氨酸合成酶CS家族[16,21]。因而，PLP附着的关键位点Lys(K)对CS功能的行使至关重要[21]。例如，拟南芥AtOASSK46A突变体表现为Cys合成酶活性丧失[22]。在山黧豆中，将PLP附着关键位点的Lys突变后，进行E.coliNK3功能互补分析和酶活检测均表明，LsCS及LsCAS突变体酶活丧失[14, 17]。本研究在分子排阻试验中，检测到LsCAS蛋白在412 nm波长下具有PLP的特征吸收峰，进一步证实了上述结论。

拟南芥、大豆等作物中的研究表明，植物硫代谢途径调控的一个典型特征是2个CS同源二聚体与2个SAT同源三聚体共同形成半胱氨酸调控复合物CRC，并通过复合物的聚合/解聚状态调节CS与SAT酶活[18-20]。当形成CRC复合物时，会降低CS的活性而升高SAT活性[23]。山黧豆LsCAS在发挥功能时，可通过与LsSAT2互作起到β-ODAP生物合成调控分子开关的作用[14]，这暗示LsCAS与LsSAT2可能通过CRC复合物的形成调控二者酶活。将LsCAS与LsSAT2采用梯度摩尔比例混合后，在降低LsCAS酶活的同时确实会增加LsSAT2活性[14]。本研究利用分子排阻法证实，LsCAS可能以四聚体方式存在，说明LsCAS可能以两个二聚体方式参与CRC复合物的形成。

CRC的聚合与解聚状态由细胞内的硫含量决定[24]。在硫充足情况下，山黧豆LsCAS 和LsSAT2形成CRC调控复合物，增强了SAT活性；充足的硫供应保证了Cys的合成，进而在游离LsCAS作用下合成BIA及β-ODAP。在低硫情况下，OAS的积累促使CRC解聚，降低了SAT活性；低水平的Cys限制了以其为底物的BIA及β-ODAP合成。但积累的OAS可在CS催化下和异噁唑-5-酮以较低效率合成BIA[14]。

综上所述，本研究克隆了山黧豆LsCAS基因的CDS序列，通过原核表达获得了山黧豆LsCAS蛋白并利用Western-blot进行了验证。在此基础上，利用分子排阻试验证实了LsCAS为PLP依赖性蛋白酶，可能以四聚体方式发挥作用。在拟南芥中，AtCYS-C1编码的AtCAS蛋白定位于线粒体，主要参与氰基代谢和根毛发育[25-26]。那么，山黧豆LsCAS是否和拟南芥AtCAS具有相同的作用方式、其功能是否存在差异，有待进一步研究。