黄芪甲苷对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的保护作用及机制

吴月鹏 邱 爽 康 妍 高 敏 陈美华 张颜波

1.山东第一医科大学第二附属医院神经内科，山东泰安 271000；

2.山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东泰安 271016

阿尔茨海默病（AD）是一种发生于老年患者的慢性进展性中枢神经系统退行性疾病［1］。据统计，全球阿尔茨海默病患者己超过2 600万，我国已有超过500万阿尔茨海默病患者［2］。阿尔茨海默病患者早期出现空间定向障碍和记忆障碍，后出现进行性认知功能障碍，造成极大的家庭负担和社会负担。虽然研究发现阿尔茨海默病有多种发病机制，也发现部分药物可以适当缓解阿尔茨海默病患者的症状，但尚未发现能够逆转或阻断阿尔茨海默病的特效药物［3］。

氧化应激损伤是阿尔茨海默病的重要发病机制，在阿尔茨海默病脑标本中发现，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，说明阿尔茨海默病患者神经细胞抗氧化能力减弱，导致自由基增加，促使神经元凋亡［4］。黄芪甲苷作为补气中药黄芪的主要成分，可以提高神经细胞SOD活性，减轻氧化应激损伤［5］，具有神经细胞保护作用。我们拟通过实验证实，黄芪甲苷可以通过减轻阿尔茨海默病模型小鼠神经细胞氧化应激损伤，达到改善阿尔茨海默病模型小鼠记忆障碍的效果，并研究其抗氧化机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年健康昆明种小鼠60只，平均体重（20±5）g，由山东第一医科大学药理学实验动物中心提供。适宜的温度和湿度条件下，适应性饲养1周后，体重至30～35 g后分组。

1.1.2 实验试剂 黄芪甲苷（成都曼思特生物科技公司），多奈哌齐（江苏豪森药业集团有限公司），氢溴酸东莨菪碱（上海士峰生物科技有限公司），MDA试剂盒、T-SOD试剂盒及考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所），无水乙醇和冰乙酸（天津市富宇精细化工有限公司），生理盐水（山东华信制药集团股份有限公司）。

1.1.3 实验仪器 全套手术器械（上海恒平科学仪器有限公司），明暗箱测试系统（北京吉安德尔科技有限公司），Morris水迷宫实验分析系统（上海欣软信息科技有限公司），酶标仪［帝肯（上海）贸易有限公司］。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芪甲苷溶液配制 高浓度黄芪甲苷溶液（200 mg/kg）由20 mg黄芪甲苷加纯水配制而成。配制200 mL高浓度黄芪甲苷溶液于棕色瓶中，储存在4℃冰箱内。将100 mL高浓度黄芪甲苷溶液（200 mg/kg）等体积稀释得到200 mL中浓度黄芪甲苷（100 mg/kg）溶液，储存于棕色瓶中，放置在4℃冰箱内。低浓度黄芪甲苷溶液（50 mg/kg）稀释储存方法同上。

1.2.2 分组与给药 将60只健康昆明小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、黄芪甲苷高浓度组、黄芪甲苷中浓度组、黄芪甲苷低浓度组6组，每组10只。黄芪甲苷高、中、低浓度组分别灌胃200、100、50 mg/kg黄芪甲苷溶液，0.1 mL/（10g·d），1天1次，每天同一时间灌胃，连续灌胃14天。阳性对照组每天灌胃30 mg/kg多奈哌齐。空白对照组、模型组每天灌胃同等剂量纯水。第15天开始行为学实验，至各组小鼠处死前，每天按照上述剂量灌胃。

1.2.3 东莨菪碱致记忆障碍动物模型的构建 灌胃给药30 min后，给予模型组、阳性对照组、黄芪甲苷高、中、低浓度组小鼠腹腔注射东莨菪碱注射液1 mg/kg，空白对照组小鼠腹腔注射同等剂量的0.9%生理盐水［7］。动物模型构建完成30 min后开始行为学实验。

1.2.4 学习记忆能力测试 学习记忆能力测试使用避暗实验［8］。本次避暗实验共进行3天。第1天，将小鼠放入避暗测试箱明室中，在明、暗两室间自由适应2 min后取出；第2天，将小鼠放入明室，待其进入暗箱后，关闭两室间洞门，并向暗室底部栅栏通电2 s，间隔10 s后再通电2 s，10 s后取出；第3天，再将小鼠放入明室，监测小鼠第1次从明室进入暗室的时间，记录为步入潜伏期，同时监测2 min内小鼠进入暗箱的次数。

1.2.5 空间位置实验 空间位置实验使用Morris水迷宫实验［9］。本次实验在第3象限中央安装平台，低于水平面1 cm，共进行6天。第1至5天进行定位航行实验，每日将小鼠依次从4个入水点放入水池中，监测小鼠入水至爬上平台的时间，记录为逃避潜伏期。取4个入水点所得的逃避潜伏期的平均值为本日逃避潜伏期结果。第6天进行空间探索实验，移去水下平台，在原平台的对侧放入小鼠，使用顶部摄像机拍摄小鼠60 s内的运动轨迹，使用分析软件获取小鼠进入目标象限的次数、在目标象限滞留的时间和游泳路程。每只小鼠测试1次。

1.2.6 丙二醛（MDA）和总超氧化物歧化酶（TSOD）活力测定 行为学实验结束后，对小鼠进行深度麻醉，断头后，在冰盘上迅速取脑，分离海马和皮层，按组织重量加9倍生理盐水制备脑组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清后保存于-20℃冰箱。

根据MDA和T-SOD试剂盒说明书，测定丙二醛含量和T-SOD的活力，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。

1.3 统计学分析

实验所得数据以（）表示，利用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，多组间比较使用单因素方差分析，两组间采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 避暗实验结果

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠步入潜伏期显著缩短（P＜0.05），错误频次显著增加（P＜0.05），提示模型组小鼠学习记忆能力受损。与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高、中浓度组和阳性对照组、空白对照组小鼠步入潜伏期显著延长（P＜0.05），黄芪甲苷高、中、低浓度组和阳性对照组小鼠错误频次显著减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠避暗实验结果（±s，n=10）

表1 各组小鼠避暗实验结果（±s，n=10）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

2.2 定位航行实验结果

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠各天逃避潜伏期显著延长（P＜0.05）。与模型组小鼠相比，黄芪甲苷中浓度组和阳性对照组小鼠各天逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠定位航行实验结果（±s，n=10，s）

表2 各组小鼠定位航行实验结果（±s，n=10，s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别剂量（mg/kg）逃避潜伏期第3天42.65±4.55 38.81±8.33*41.73±3.57 47.63±6.69#36.48±1.37*32.02±1.90*第5天38.00±3.54 31.68±6.27*36.06±4.92 43.89±4.83#29.93±8.77*28.08±4.18*第4天41.50±9.85 35.46±2.47*39.18±7.07 46.36±9.67#33.62±5.28*30.75±5.95*200 100 50 30第2天44.49±9.69 40.01±2.49*44.26±2.86 49.81±4.31#37.18±4.82*36.43±9.16*第1天47.65±6.99 41.09±7.68*46.13±4.52 53.81±7.18#42.33±5.29*39.71±3.93*高浓度中浓度低浓度模型组阳性对照组空白对照组

2.3 空间探索实验

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠进入目标象限次数、在目标象限内游泳时间、在目标象限内游泳路程3个指标均显著降低（P＜0.05）。与模型组小鼠相比，黄芪甲苷中浓度组和阳性对照组小鼠进入目标象限的次数、在目标象限内的游泳时间、在目标象限内游泳路程显著增加（P＜0.05）；与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高浓度组小鼠在目标象限内的游泳时间、在目标象限内游泳路程显著增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠空间探索实验结果（xˉ±s，n=10）

2.4 生化指标结果

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠脑组织MDA含量显著升高（P＜0.05）、T-SOD活力显著降低（P＜0.05）。与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高、中、低浓度组，阳性对照组小鼠脑组织MDA含量显著降低（P＜0.05），T-SOD活力显著升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠生化指标结果（±s，n=10）

表4 各组小鼠生化指标结果（±s，n=10）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3 讨论

阿尔茨海默病是一种以认知功能损伤和行为障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病。作为痴呆症的主要原因，阿尔茨海默病约占痴呆病例的60%～80%，是痴呆的主要病因［10］，而且至今未找到理想的药物逆转和治愈阿尔茨海默病所导致的痴呆症。为减轻阿尔茨海默病对社会和家庭带来的沉重负担，阿尔茨海默病的发病机制和治疗方案成为众多学者研究的热点。

东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍模型是阿尔茨海默病经典药物筛选模型［7］。东莨菪碱是乙酰胆碱拮抗剂，可模拟乙酰胆碱不足造成的学习记忆障碍。本次实验也证实，在避暗实验中，与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠步入潜伏期显著缩短、错误频次显著增加，提示模型组小鼠被动回避记忆能力受损。在定位航行实验中，与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠各天逃避潜伏期显著延长。在空间探索实验中，与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠进入目标象限次数、在目标象限内游泳时间、在目标象限内游泳路程3个指标均显著降低，提示模型组小鼠空间记忆能力受损。以上结果表明本次东莨菪碱致小鼠记忆障碍模型构建成功。

氧化应激是阿尔茨海默病的重要发病机制［11］。由于脑组织的独特结构，脑内氧含量较高，抗氧化物较少，所以脑组织易于受到氧化应激损伤。阿尔茨海默病的病理特征表现为β淀粉样蛋白（Aβ）在脑内异常沉积，沉积达到一定程度时可导致SOD等抗氧化酶活性降低，氧化应激因子MDA等增加，导致神经细胞变性及神经系统退行性疾病。通过本次实验也证实，与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠脑组织MDA含量升高，T-SOD活力降低，说明氧化应激是阿尔茨海默病的发病机制之一，表现为MDA含量升高，T-SOD活力降低。

中药具有多靶点作用，在众多不可治愈的疾病中显示出不同程度的疗效。有研究表明中药可被推荐用于阿尔茨海默病患者的常规治疗，其机制可能与激活多种信号通路有关［12］。黄芪作为最古老的传统中药之一，具有补中益气、扶正固本的功效。黄芪甲苷是黄芪的有效活性成分，研究表明黄芪甲苷能够有效改善Aβ1-42所致大鼠海马组织SOD活性下降［13］。

我们通过实验证实，在避暗实验中，与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高、中浓度组和阳性对照组、空白对照组小鼠步入潜伏期显著延长，黄芪甲苷高、中、低浓度组和阳性对照组小鼠错误频次显著减少，提示黄芪甲苷对东莨菪碱致小鼠被动回避记忆能力损伤具有改善作用。在定位航行实验中，与模型组小鼠相比，黄芪甲苷中浓度组和阳性对照组小鼠各天逃避潜伏期显著缩短；在空间探索实验中，与模型组小鼠相比，黄芪甲苷中浓度组和阳性对照组小鼠进入目标象限的次数、在目标象限内的游泳时间、在目标象限内游泳路程显著增加；与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高浓度组小鼠在目标象限内的游泳时间、在目标象限内游泳路程显著增加；提示黄芪甲苷对小鼠空间记忆能力损伤有改善作用。

本研究生化指标结果显示，与模型组小鼠相比，黄芪甲苷高、中、低浓度组和阳性对照组小鼠脑组织MDA含量显著降低，T-SOD活力显著升高，提示黄芪甲苷对东莨菪碱致小鼠记忆障碍模型的氧化应激损伤具有改善作用。

综上所述，黄芪甲苷可以改善东莨菪碱致小鼠的学习记忆障碍，其作用机制可能与增加SOD水平和降低MDA水平有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突