强直性脊柱炎的脂质组学研究

殷婷婷 赵 铁 赵春杰 张英泽

1.郑州大学附属郑州中心医院药学部，河南郑州 450000；2.卫生部中日友好医院药学部，北京 100029；3.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016；4.卫生部中日友好医院中医风湿病科，北京 100029

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种以中轴关节的慢性炎症为特征的全身性疾病，主要累及骶髂关节，引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度的骨骼、肌肉病变，属于自身免疫性疾病［1］，其发生与遗传、慢性感染、自身免疫功能紊乱等多种因素有关，但确切病因和发病机制至今尚未完全明确。随着对AS研究的不断深入，临床上逐渐发现了一些与AS活动度有关的生物标志物，有研究认为，患者的炎症水平与血脂有关［2-3］。

脂类物质是组成生物体的基本物质之一，在生物体内复杂的生理反应过程中扮演着十分重要的角色，如构成细胞膜、充当信使分子等。已有研究表明，脂质代谢异常与人类许多疾病有密切关系，如癌症、糖尿病［4-5］、阿尔兹海默病［6］等。随着脂质研究的逐渐深入，脂质组学（lipidomics）的概念应运而生［7］，即从系统水平上研究生物体内脂质分子的结构、功能及其在体内的代谢变化，分析脂代谢网络的作用机制，确定其中关键的脂质及相关酶，以期发现潜在的异常代谢途径或致病机制，从而发现有效的诊断和治疗手段［8］。脂质组学作为代谢组学的一个分支，其研究方法与代谢组学基本相似，包括样品采集和制备、数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和生物解析等多个步骤。本研究拟利用脂质组学研究AS，寻找可能的AS脂类代谢标志物，为AS的机理研究提供一定的依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

AS组：61例，年龄18～65岁；符合AS的诊断标准：①腰痛、晨僵3个月以上，活动改善，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。放射学标准：骶髂关节炎，双侧≥2级或单侧3～4级。同时符合放射学标准和1项（及以上）临床标准者确诊为强直性脊柱炎。患者对本研究知情同意。排除合并有类风湿关节炎、银屑病性关节炎、风湿病以及其他血清阴性脊柱关节病患者，精神病患者，不能正确理解和填写问卷调查表者，有心、脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者，晚期严重关节畸形、残废的患者［9-10］。

对照组（C组）：健康志愿者22例，18～65岁，无风湿性疾病或其他重大疾病。经统计学分析两组年龄差异无统计学意义。本研究通过伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 检测仪器与试剂 低温离心机（德国Heraeus公司）；BS 224S精密分析天平（德国赛多利斯公司）；离心浓缩仪（太仓市科教器材LNGT98A）；超高压液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（UPLC/MS/MS，美国Waters公司）；液相色谱柱（BEH，5 cm×1.0 mm，1.7μm，美国Waters公司）；2，6-Di-tert-butyl-4-methylphenol（BHT，美国，SIGMA）；乙腈（梯度级色谱纯，德国，MERCK）；异丙醇（梯度级色谱纯，德国，MERCK）；甲醇（色谱纯，德国，MERCK）；氯仿（色谱纯，美国，Honeywell）；甲酸铵（分析纯，德国，CNW）。

1.2.2 样品的采集与制备 用无添加剂的真空采血管采全血5 mL，在4℃、3 000 r/min的条件下，离心10 min，取血清。血清中脂质的提取方法参考文献［11］确定如下：精密移取150μL血清于离心管中，加超纯水50μL，加入甲醇-氯仿（2∶1，含0.01%BHT）800μL，涡旋30 s，静置30 min后，再加入550μL氯仿和200μL 0.9%NaCl溶液，涡旋30 s后13 000 r/min离心15 min，分别吸取下层清液30μL和700μL于离心管中，离心浓缩至干后分别加30μL甲醇-氯仿（体积比1∶1）和100μL甲醇-氯仿（体积比1∶1）混合溶剂，涡旋30 s复溶，再分别加入270μL和400μL甲醇稀释，13 000 r/min离心15 min，吸取上层清液进样，分别进行正、负离子脂质指纹谱分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Acquity BEH C18分析柱（5 cm×1.0 mm，1.7μm），柱温50℃，流动相A相：乙腈-异丙醇（体积比5∶2，含1%的甲酸铵），B相：超纯水（含1%的甲酸铵），流速0.2 mL/min，每次进样1μL，采用梯度方式洗脱样品。梯度洗脱程序如下：A相从35%线性升高到65%（0～3 min），维持1 min，然后线性升高到95%（4～6 min），再逐渐升高到100%（6～9 min），维持3 min后，逐渐回到起始梯度，分析过程共计17 min。

1.2.4 质谱条件 质谱采用正、负离子两种采集模式，正离子采集模式毛细管电压3.50 kV，锥孔电压40.00 V；负离子采集模式毛细管电压3.00 kV，锥孔电压30.00 V，两种采集模式均为：离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量600 L/h，采集时间范围0～17 min，扫描范围m/z 400～1 000，扫描时间0.6 s，扫描间隔时间0.05 s。

1.3 数据的处理和分析

由Markerlynx（Waters，USA）软件进行色谱峰自动识别和峰匹配，数据处理后导入SIMCA-p（Umetrics，Sweden）软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），同时采用独立样本t检验和非参数（Mann-Whiteney，M-W）检验来考察代谢物组间差异有无统计学意义，寻找出潜在的脂质生物标记物并利用质谱提供的各个峰的精确质量数、偶氮原则、特征碎片等信息，结合一些专业数据库（如HMDB、Lipidmaps等）进行定性鉴别。

2 结果

2.1 脂质指纹图谱

经UPLC/MS分析后得到两组血清样本脂质指纹色谱图（图1），在一个分析时间中有多种不同的体内内源性脂质代谢物同时被检测到，如GPC、Lyso-GPC、GPE、SM、TG等。

图1 各组血清样本UPLC/MS分析的代表性总离子流（TIC）色谱图

2.2 AS组和C组的模式识别分析

从AS组和C组两组样本的PCA结果（图2）可以看出，两组的重叠部分较多，分离趋势不明显，所以进一步采用有监督式模式识别的PLS-DA进行分析，从结果（图3）可以看出两组在正、负离子两种模式下得到的数据都可以完全分开，表明AS患者和正常人之间的脂质代谢网络存在明显的差异。

图2 强直性脊柱炎和对照组的PCA结果

图3 强直性脊柱炎和对照组的PLS-DA结果

2.3 AS特异性脂质代谢物的寻找

将AS组与C组的PLS-DA分析结果与统计学结果相结合，得到许多差异变量，对这些变量进行定性鉴别，共鉴定出21种脂类代谢物（表1）。由表1可以看出，与C组相比，AS患者体内的这21种差异脂质均存在下降趋势，其中TG类最为明显。

表1 强直性脊柱炎和对照组间的差异脂质代谢物

3 讨论

3.1 样本的选择

AS多见于青壮年，且女性患病率远低于男性，本研究由于时间所限，选入经诊断的AS患者恰好全部为男性。所以为了排除疾病以外的年龄、性别因素，本研究选择的正常健康者也均为男性，年龄与AS组相匹配且差异无统计学意义。未来可以考虑进一步扩大样本数，同时注意纳入女性患者和正常健康者。

3.2 数据的处理和分析

UPLC/MS分析获得的原始数据由MarkerLynx 4.1进行提取，得到包括峰指征（保留时间及m/z）、样品名称和离子强度的三维矩阵。为了排除噪音的干扰，先除掉正常和模型样本中缺失值超过30%的变量，再对数据进行对数变化、中心化转、提取。数据提取后得到的三维矩阵中隐含大量的信息，但由于矩阵的多元性和复杂性，使得我们难以直接对其进行分析，所以将数据导入SIMCA-p（Umetrics，Sweden）软件进行PCA和PLS-DA分析。

通过PLS-DA分析，变量对分类的重要程度可以由变量重要性（variable importance in the project，VIP）值的大小来衡量，VIP值越大，对应变量对分类的贡献就越大。由于多维统计方法同时受相关性和组内组间方差等因素的影响，有时找到的差异变量可能单维上差异无统计学意义或者是在多维统计上会出现不稳定的结果，因此必须在多维统计的基础上加以单维统计验证。因此综合考虑，本研究选择VIP＞1同时满足独立样本t检验和M-W检验P＜0.05的变量作为潜在的脂质生物标志物。

3.3 脂质生物标志物

实验共发现21种差异脂质，与C组相比AS患者体内的这些差异脂质均存在下降趋势，其中TG类最为明显。由文献报道可以看出，AS的病因机制虽然还未明了，但是普遍认为AS是一种自身免疫性疾病，与T细胞亚群失衡及细胞因子分泌异常密切相关。瘦素（leptin）作为细胞因子网络中的一种重要调控因子［12］，近年来在类风湿性关节炎等自身免疫疾病中得到了广泛关注。leptin是一种由脂肪组织分泌的非糖基化蛋白类激素，主要功能是通过与下丘脑的相应受体结合，参与糖、脂肪及能量代谢的调节，促使机体减少摄食，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成，进而使体重减轻。除此之外，越来越多的文献表明leptin不但参与能量的代谢，其在免疫系统中也发挥着重要的作用。Park、张征等［13-14］研究发现血清中leptin含量的升高与AS患者的病情活动密切相关且lpetin的mRNA和蛋白表达与IL-6表达成正相关，李国青等［15］研究也发现AS患者外周血和关节滑液中leptin及Th17相关细胞因子的含量较年龄、性别匹配的健康对照者显著升高。所以结合本实验研究的结果，推测可能是AS患者体内血清中的leptin含量高于C组，从而抑制了脂肪的合成，增加了能量的消耗，导致TG类含量的下降，其中以TG（54∶7）为代表的16种TG在两组中差异有统计学意义，提示以TG（54∶7）为代表的16种TG可以作为AS的特异性脂质代谢标志物。

通过与C组对比还发现AS患者血清中的Lyso-GPC与正常人相比也呈下降趋势。大量研究证明Lyso-GPC是前炎症因子，Ryborg等［16］在研究中发现患有牛皮癣的皮肤中Lyso-GPC的含量明显高于正常皮肤，同时也证明了Lyso-GPC在炎症部位的聚集会导致炎症程度的进一步加剧。因此，我们猜测AS患者血清中Lyso-GPC（18∶2）、Lyso-GPC（16∶1）的含量与正常人相比显著下降的原因可能是因为它们在组织或关节中产生了一定程度的聚集，而正是由于Lyso-GPC的聚集，才导致了炎症的产生或进一步加剧。

本研究以“组学”技术为分析手段，研究AS患者和正常健康者血清中的脂类代谢物，发现了多种存在显著差异的脂质，如TG（54∶7）、Lyso-GPC（18∶2）、Lyso-GPC（16∶1）等，这些脂质对AS与正常健康者的分型有显著贡献，因此推测这些差异脂质代谢物可能是AS的特异性脂质代谢标志物，能为AS的临床研究提供一定的理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突