mRNA疫苗研究进展——2021年拉斯克奖临床医学研究奖

陈 彦 孙 英

(首都医科大学基础医学院免疫学系，北京 100069)

2021年，mRNA疫苗占据世界顶尖科学家协会(World Laureates Association，WLA)全球发布的年度报告之首，并在MIT Technology Review 被评选为2021年“全球十大突破性技术”之一；与此同时，2021年拉斯克(The Lasker Awards)临床医学研究奖授予了在mRNA技术上做出开拓性贡献的Katalin Karikó 与Drew Weissman(图1),他们联合发现的基于mRNA修饰的创新治疗技术不但让快速开发mRNA新型冠状病毒疫苗成为可能，而且正在用于治疗和预防一系列其他疾病[1]。mRNA疫苗又称信使RNA(messenger RNA，mRNA)疫苗，是将合成的编码蛋白质抗原的mRNA序列递送至体内指导机体表达相应的蛋白质，并诱导机体产生针对该蛋白的免疫应答以实现疾病预防和治疗的目的。mRNA疫苗具有良好的安全性和灵活的生产工艺，被认为是开发新型治疗手段的一个重要工具。本文将从mRNA疫苗的发展历程、技术原理、疫苗递送系统和mRNA 疫苗在临床应用的情况等方面作一综述。

图1 Katalin Karikó[1]

1 临床医学研究奖

2021年拉斯克(The Lasker Awards)临床医学研究奖的获奖者Katalin Karikó一生专注于mRNA的研究，但前期研究经历坎坷。在博士毕业后就在匈牙利科学院下属的生物研究中心工作，由于没有科研成果，30岁时被解雇。1989年，她加入宾夕法尼亚大学，因为拿不到经费，没有项目，也没有成果，她又被降职。直到1997年，她遇到了刚在宾夕法尼亚大学成立了自己实验室的Drew Weissmanm并开始mRNA疫苗合作研究，一起开发针对HIV/AIDS的mRNA疫苗。但是，Karikó将mRNA注射到小鼠体内时产生了明显的炎性反应。经过深入分析，他们发现：这种合成的mRNA激活了Toll样受体，这些受体能在第一时间对来自病原体的危险信号作出响应而引起炎症发生，但通过重新编排mRNA的一个核苷酸-尿苷的化学键，创造出假尿苷的类似物，就可以防止机体将合成的mRNA视为敌人，这一重要研究成果发表在2005年的Immunity上。在新型冠状病毒肺炎疫情中，他们联合发现的基于mRNA修饰的创新治疗技术不但让快速开发新冠疫苗成为可能，并且由于mRNA疫苗在对抗新冠肺炎疫情中展现出的惊人保护效果，为其后续用于治疗和预防一系列其他疾病奠定了一定基础。

图2 Drew Weissman[1]

2 mRNA疫苗发展的历史进程

mRNA 疫苗是继传统疫苗(灭活疫苗、减毒活疫苗)和新型疫苗(亚单位疫苗和病毒载体疫苗)后的第三代疫苗，具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化扩大和安全有效性高等特点。

在过去的30 年里，mRNA 疫苗研发已完成了基础平台的搭建。1987年，Malone等[2]率先发现将mRNA链和脂滴一起，可使mRNA被人体细胞吸收并合成蛋白。随后，同一实验室的研究证明青蛙胚胎也能吸收mRNA。这些研究表明导入机体细胞中的mRNA能够指导表达出目的蛋白。1990年，Wolff等[3]将编码β-半乳糖苷酶的mRNA成功在小鼠骨骼肌表达所编码的酶，证明了体外转录mRNA 可在机体组织内表达相应蛋白质，为mRNA治疗研究拉开了序幕。加之mRNA只需体外转录就可以人工合成，且造价低廉，从此后的十几年里，众多科学家和医药公司开始尝试mRNA疫苗的研究，但后续的研究发现，人工合成的mRNA免疫的动物体内会产生针对该核酸编码抗原的免疫应答而影响其效应，而且mRNA自身不稳定, 容易被RNA酶降解，这些问题又使其发展受到限制，使得当时很多尝试开发mRNA疫苗的公司都放弃了对mRNA疫苗的研究。mRNA疫苗里程碑式的转折始于匈牙利生物化学家Katalin Karikó和美国免疫学家 Drew Weissman把假尿苷加入到人工合成的mRNA，通过改变mRNA的密码子从而帮助合成的mRNA躲过细胞的固有免疫防御，避免激活Toll样受体所引起的免疫应答[4-5]，而且显著增强了mRNA表达蛋白的能力。此后，mRNA结构研究等相关技术得到了迅速发展。

21世纪初始，伴随着化学合成、纳米材料制造水平的提升，mRNA的制备过程和递送技术的发展，mRNA在体内的表达效率大大提高，mRNA本身的免疫原性也进一步降低，提高了安全性。自此，众多大型药企大举向mRNA疫苗的应用进军。2017年，Sahin等[6]首次报道了将针对多种抗原的个性化mRNA肿瘤疫苗应用于治疗黑色素瘤患者的临床试验, 结果显示13名受试者中有8名得到了有效治疗, 并且1 年内没有复发。尽管如此，但mRNA疫苗一直未正式应用于临床，而新冠疫情的出现加速了这一进程。2020年，美国Moderna和德国BioNTech公司的新型冠状病毒mRNA疫苗通过美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)紧急授权并开始免疫接种[7]，该项授权成为临床应用方面的重大进展, 同时也在全球掀起了mRNA治疗研究的热潮。至此，mRNA疫苗是作为一种此前从未用于治疗的技术，掀开了其在医学发展史中的新篇章。

3 mRNA疫苗技术原理及制备过程

3.1 mRNA疫苗分类

mRNA疫苗分为自我扩增型(self-amplifying，SAM)以及非复制型(non-replicating)两种类型。SAM mRNA疫苗的设计是将编码病毒结构的基因用外源靶蛋白基因(抗原基因)替换，即在保留了病毒基因组自我复制能力的同时又不能合成病毒蛋白，具有较好的安全性，且引起较强的免疫应答。非复制型的mRNA疫苗只含有体外转录好的编码蛋白质抗原的mRNA，优点是结构简单, 但需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发有效的免疫应答，且这种合成的mRNA在人体内无法自我复制。

3.2 mRNA疫苗合成修饰

mRNA作为一种外源的核酸物质，进入体内后很容易被免疫系统识别和被核酸酶降解，为了保证mRNA疫苗的稳定性和免疫活性，目前已开发了多种mRNA修饰技术，主要包括：① 通过“加帽法”增强mRNA的稳定性和促进翻译起始，以防止5′核酸外切酶对其降解；最近, Trilink公司研发出的CleanCap技术, 使得共转录产生天然Cap1结构成为可能。②在5′和3′ UTR 区域增加可调控序列，提高mRNA 转译率和延长mRNA 半衰期；③修饰3′ Poly (A)尾稳定mRNA，增强蛋白质翻译；研究[8]表明，3′UTR的特异性修饰可通过影响脱腺苷率而减缓Poly(A) 尾的衰变。④修饰核苷酸，减少固有免疫激活；⑤优化序列，选择与tRNA同源的密码子，提高翻译率。

4 mRNA疫苗诱导免疫应答的机制

与传统疫苗向人体注入减弱或灭活的病原体来触发免疫反应不同，mRNA疫苗可指导体内细胞合成某种蛋白质或者蛋白质片段，从而触发机体的免疫应答。

4.1 mRNA疫苗所诱导的免疫应答

固有免疫是人体免疫系统的第一道防线，可以通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，从而启动免疫应答。mRNA疫苗作为外源的核酸物质，表现出与病毒mRNA相似的特性。它可被抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)识别，激活Toll样受体3(Toll like receptor 3, TLR3)、TLR7和TLR8等模式识别受体，促进APCs的成熟、促进炎性细胞因子和I型干扰素(interferon，IFN)的产生[8-9]。上述过程最终可诱导机体产生细胞和体液免疫应答，对机体产生预期的免疫保护效应。如果mRNA刺激的免疫应答过度则会使被刺激细胞分泌大量的I型干扰素，抑制mRNA的翻译和促进mRNA的降解，从而下调目的蛋白的表达，对免疫应答产生负向的反作用[10-11]。这可能会对一些mRNA疫苗的应用产生负面影响。因此有必要根据不同的应用需求对mRNA免疫原性进行适度调控，从而有效提高疫苗的应用效果。

4.2 mRNA疫苗递送系统

根据蛋白质抗原需要表达的位置，可将mRNA疫苗进行系统给药或者局部给药，通常皮下和肌肉注射的局部给药可以引起较强的免疫应答，方便进行预防接种；如果是治疗性mRNA疫苗通常通过腹腔或者静脉注射系统给药，这些给药方式都有助于刺激抗原提呈和启动免疫应答。然而，给药方式的不同将会使mRNA疫苗在体内的代谢以及目的蛋白翻译的效率受到影响。

RNA难以通过自由扩散的方式穿过细胞膜。因此，有效地将mRNA以高水平输送到足量的细胞成为mRNA疫苗应用中的难题之一，而高特异性和高效的mRNA递送系统也成为亟待解决的关键问题[12]。目前，科学家已经研发了多种递送载体，常用的载体包括树突状细胞(dendritic cell, DC)、鱼精蛋白、多聚体载体和脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNPs)等。

DCsmRNA递送系统主要是通过体外途径将编码肽、蛋白质等其他抗原的mRNA转染到DC中，然后将转染的的DCs回输至机体，启动抗原特异性免疫应答，在这个过程中单独的DCsmRNA递送系统就可以产生较高的递送效率，现已被广泛应用于动物模型和临床研究[13-14]。此外，由于主要介导细胞免疫应答，其临床应用以肿瘤治疗为主。

鱼精蛋白是通过将mRNA分子络合成纳米级别的核酸颗粒，以阻断RNA酶对mRNA降解；但受二者组合比例和结合紧密性的影响，采用这种方式制备的mRNA疫苗的蛋白表达效率会受限。近年来，鱼精蛋白mRNA给药系统被广泛应用于临床试验，并在狂犬病、肺癌等临床治疗中取得了较好的效果[15-16]。

在多聚物载体材料中，聚乙烯亚胺(polyethylenimine ,PEI)是使用最为广泛的mRNA疫苗载体；大分子量的PEI更适合作为自我复制性mRNA疫苗的载体，但它同时会带来较强的不良反应，且其对mRNA的结合非常稳定以至于无法顺利的将mRNA释放至细胞质；而小分子量的PEI转染能力有限。除了PEI外还有其他的分子被用来作为载体，例如聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)等。

脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)是目前最先进的递送系统，mRNA处于LNP的核心位置，不易被核酸酶降解，且LNP的亲脂性使其易与宿主细胞膜融合，进而以内吞的方式将mRNA传递至细胞内。在早期的研究中，LNP的安全性就已在siRNA的传递中证明。Geall等[17]的报道显示由LNP递送的SAM RNA疫苗中的mRNA在小鼠体内的表达水平明显高于裸mRNA，并能有效诱导CD4+/CD8+T介导的免疫应答。此外，根据靶向不同疾病的需求，LNPmRNA可以通过采用不同方式的给药策略达到激发不同区域的免疫效应。近期的新冠疫苗大规模临床试验表明，LNP作为mRNA 的递送载体，其安全性和递呈效果较理想。

综上，与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有独特的优势：①相比需要入核的DNA, mRNA不进入细胞核内部，只需要在细胞质内表达目的蛋白；②mRNA 本身不具备感染性，亦能通过正常细胞途径降解，并不存在感染或插入突变的风险。③mRNA可以表达特定序列的靶蛋白诱导特异性免疫反应，序列修饰/优化可以使mRNA的稳定性和翻译效率显著提高；④mRNA设计、合成方法简便，易于在体外开展大规模生产，有利于传染病的防控[18]。

5 mRNA疫苗与临床应用

随着 mRNA制备技术和应用领域的不断拓展，多种mRNA 疫苗在传染性疾病以及肿瘤等临床前及临床研究阶段取得了较好的结果。

5.1 传染性疾病mRNA疫苗

针对传染性疾病疫苗生产的最大难点是在短时间内获得足量的疫苗, 而mRNA疫苗可以解决这一问题。

首个用于疾病预防的mRNA疫苗是流感疫苗[19]。由于流感病毒的血凝素和神经氨酸酶极易发生变异，而且缺乏可以有效对抗此种突变病原体的广谱性疫苗，Modena TX 公司以LNP为载体，率先完成了H10N8 和H7N9 流感疫苗的Ⅰ期临床试验[20]，结果显示mRNA疫苗对甲型流感具有明显的预防保护作用，且在人体内具有较强的免疫原性、较好的安全性和耐受性。Meyer等[21]研发的针对2种编码埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)糖蛋白的 mRNA疫苗注射给EBOV感染的豚鼠后，感染EBO豚鼠体内可产生EBOV 糖蛋白特异性IgG抗体以及EBOV中和抗体，并且豚鼠的存活率可达100%。Roth等[22]以Ⅰ型登革病毒(Dengue virus，DENV)非结构蛋白作为目的抗原设计了一个LNP修饰的编码DENV1-NS的 mRNA疫苗，将其免疫HLA Ⅰ类分子转基因小鼠后，发现能够诱导该小鼠产生病毒特异性CD8+T细胞，发挥保护作用。Pardi等[23]采用针对寨卡病毒prM-E (pre-membrane and envelope)的mRNA-LNPs免疫小鼠和非人灵长类动物，结果显示mRNA-LNPs单次免疫即可快速诱导产生高效价中和抗体以及持久的免疫效应。Modena TX 公司针对寨卡病毒的非复制型mRNA-LNPs 疫苗已完成Ⅰ期临床试验，但结果尚未发布。CureVac AG 公司研制的狂犬病疫苗CV7201 已完成 Ⅰ 期临床试验[24]。临床前研究[25]显示，该疫苗对小鼠和猪表现出了良好的免疫原性和保护效果，皮下免疫显示与已上市的Rabipur 疫苗具有类似的效果。另有临床试验将编码有HIV-1抗原、人类巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)pp65抗原的mRNA在体外转染自体DC, 然后将自体DC再回输个体, 以激活特异性的细胞免疫，结果同样显示mRNA具有安全性并能引起T细胞介导的免疫应答。

由重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2) 引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在全球蔓延，严重影响了人类生命健康和社会稳定，接种疫苗是控制疫情暴发和病毒传播的有效防治手段。面对突发的全球性COVID-19疫情, 多个国家采用多种技术平台以前所未有的速度开始了疫苗的研发。由辉瑞和BioNTech研发的针对具有融合前构象的新冠病毒刺突蛋白的BNT162b2疫苗的Ⅲ期临床试验结果表明[26-27]其预防SARS-CoV-2的有效性可高达95%，因此，BNT162b2疫苗在 2020年12月11日成为第一个获得FDA批准的SARS CoV-2 mRNA疫苗, 并确定剂量为相隔21 d的两次肌肉注射, 每次30 μg。 2020年12月18日, Moderna 公司研发的COVID-19 mRNA-1273疫苗获得FDA颁发的紧急使用授权，允许美国18岁及以上的个人使用Moderna COVID-19疫苗, 并确定剂量为相隔28 d的两次肌肉注射, 每次100 μg, 成为第2个获批使用的mRNA疫苗。mRNA-1273疫苗的mRNA 编码新冠病毒全长S 蛋白序列，为提高稳定性, 抗原蛋白986和987号残基被脯氨酸(S-2P)代替，递送系统为LNPs，Ⅲ 期临床试验结果显示该疫苗的有效率高达 94.1%, 并具有较好的安全性[7]。随后，德国Biontech SE 公司的mRNA-LNPs 疫苗分别在德国和美国进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验。该临床试验主要考察其安全性、耐受性、免疫原性等。中国在应对COVID-19疫情时采用的疫苗研发5 种技术策略也包括了新冠病毒mRNA疫苗，目前该疫苗处于研发之中，正在海外进行Ⅲ期临床试验。

5.2 mRNA肿瘤疫苗

mRNA肿瘤疫苗疗法始于Conry等[27]通过肌肉注射癌胚抗原mRNA, 使小鼠获得了抗肿瘤的免疫反应。mRNA肿瘤疫苗常用的临床方法有树突状细胞 mRNA肿瘤疫苗、mRNA肿瘤疫苗直接注射、外周血细胞mRNA肿瘤疫苗、编码嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)的mRNA等。

树突状细胞mRNA肿瘤疫苗是指将抗原 mRNA转染DC，使其递呈抗原, 从而激发机体特异性免疫应答。该疫苗自身的免疫原性不仅能够促使树突状细胞成熟, 并由此促进细胞和体液免疫应答,还可能会减少mRNA疫苗自身的翻译, 从而减少树突状细胞抗原的呈递。目前, 已开展了针对肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多种肿瘤树突状细胞疫苗的临床试验。其缺点是需要从患者的外周血中分离树突状细胞进行体外培养, 这使得整个制作周期较长，若改良为采用外周血细胞作为mRNA疫苗的载体[28]，就能够节省从外周血中分离并培养树突状细胞的时间。目前, 编码抗人间皮素基因的CAR mRNA通过电穿孔方式转染的外周血淋巴细胞已经被试用于卵巢癌的治疗[29]。编码CAR的mRNA是将编码 CAR的mRNA导入T细胞, 在T细胞膜表面表达嵌合抗原受体，从而识别并攻击特定癌细胞。与传统的CAR-T 疗法相比，编码CAR的mRNA可以介导瞬时CAR表达，从而减少不良反应的产生。mRNA疫苗也能激活体内原本输入的CAR-T细胞，如通过在小鼠体内注射CLDN6 mRNA疫苗促进树突状细胞表面CLDN6的表达, 能够激发和促进CLDN6-CAR-T细胞的效能[30]。此外，mRNA肿瘤疫苗和其他肿瘤治疗方式(如免疫检查点抑制剂、化学疗法和小分子靶点药物等)联合的组合疗法如今也被广泛使用。比如, 联合使用PD-L1 沉默的siRNA和次要组织相容性抗原mRNA肿瘤疫苗治疗血液系统疾病[31], 可以减少疫苗所受肿瘤微环境和免疫抑制因子的限制。

5.3 mRNA疫苗在其他疾病中的应用

目前mRNA疫苗在抗细菌和寄生虫感染中也有应用。Lorenzi等[32]研发的编码麻风分枝杆菌HSP65蛋白的 mRNA 疫苗，经鼻内给药后可使小鼠免受结核分枝杆菌的感染，且通过鼻内给药的途径可以减轻小鼠肺部的荷菌量和炎性反应改变，为控制实验性结核病提供了一种有效的策略。Baeza等[33]发现利用编码疟原虫产生巨噬细胞迁移抑制因子同源物(plasmodium macrophage migration inhibitory factor, PMIF)的SAM 疫苗可以产生PMIF特异性免疫反应，降低了Th1相关炎性反应因子，增强了Tfh细胞和生发中心反应，增加了抗疟原虫抗体效价，以及T细胞的分化，从而获得抗疟疾感染的保护性免疫。此外，Krienke等[34]证明在由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG3555)肽免疫小鼠建立的多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE) 的模型小鼠，在免疫后第7天和第10天接种MOG3555编码的1-甲基伪尿嘧啶(m1Ψ)mRNA，可以通过诱导产生新的FOXP3+调节性T 细胞，抑制促进疾病发生的Th1、Th17和Th1/Th17细胞的产生，且对已确诊EAE的小鼠接种该疫苗可防止疾病进一步进展，甚至可逆转病理改变。该项研究提示，m1Ψ mRNA方法具有高度的灵活性、快速性和成本效益，这可能使疫苗个性化和不同自身抗原的组合成为自身免疫性mRNA疫苗研制的一个新方式。

6 小结与展望

随着疫苗研发工作的不断开展，mRNA 疫苗技术已日趋成熟。研究[33-34]显示，mRNA 疫苗的保护效果优于同种病毒的灭活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗，而且目前的临床和临床前数据已展现出积极的应用前景，Katalin Karikó 和Drew Weissman共同获得2021年拉斯克临床医学研究奖。上述种种都预示着mRNA疫苗有望成为防控感染性疾病和开展疾病治疗的有力工具。但是，mRNA疫苗在动物模型和人体内应用的安全性和有效性仍存在较大差异，因此对于进一步提升稳定性和递送的特异性，从而提高疫苗的疗效仍是其研发的一个重要挑战；此外，优化疫苗最佳给药方式和接种剂量及次数，以及拓展其在各种疾病中的应用也是今后研究应用的重要方向。在疫苗行业逐步成熟的情况下，开发对抗突变性抗原的广谱疫苗以实现一针多能，具有为疾病提供预防和保护措施的重大意义。