具超二倍体特征的多发性骨髓瘤患者染色体核型分析

黄河，林泓豆，郭文坚，李倩

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1．血液内科；2．检验科

随着新药及新治疗方式的出现，多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）患者的总体生存期（overall survival, OS）明显延长；大部分MM患者都存在染色体核型改变，而这些细胞遗传学异常（cytogenetic abnormality, CA）对疾病的发病机制、临床症状、分期、药物疗效和预后有着重要的指导意义，尤其是蛋白酶体后时代（2017年7月进口硼替佐米万珂纳入我国医保，随后国产硼替佐米陆续上市），CA已明确成为MM危险度分层的重要指 标[1-4]。超二倍体是指除正常染色体组以外，还有一条或几条额外的染色体或染色体片段的细胞或个体，研究表明近45%的MM患者中可发现超二倍体，且该变化往往提示较好的预后，但仍有研究对其预后意义存在争议[5-6]。本研究对温州医科大学附属第二医院血液科33例初发或复发具超二倍体核型的MM病例进行染色体及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）表达研究，为MM的治疗及预后提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2009年6月至2018年7月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院收治的150例初发或复发的MM患者，均未接受过移植或CAR-T治疗。其中33例为超二倍体核型（染色体数≥47且＜75），7例亚二倍体（染色体数≤44），109例二倍体（染色体数=46），1例近四倍体（染色体数＞75）。所有MM患者诊断符合张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》[7]，分期分型按照《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2017年修订）》[8]。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析：取患者骨髓液6～8 mL，于20%小牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃采用短期培养法培养24～48 h，收集细胞，采用R带技术显带，每例标本分析20个分裂相。核型分析按照 《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2009）》描述核型。

1.2.2 FISH检测：选择数目异常常见的CSP3/7、D7S522/CSP7、D5S23D5S721/CSF1R、13/21、18XY探针，及位点和融合基因探针：RB1/D13S319 （13q14）、C-MYC（8q24）、IGH（14q32）、P53/1q21（17p13.1/1q21）、PML/RARɑ（15q21/17q21）、BCR/ABL（22q11/9q34）及CCND1/IGH（11q13/14q32）检测基因。染色体分析剩余的标本，滴片，37 ℃在2×枸橼酸钠（saline sodium citrate, SSC）缓冲液中老化30 min，后70%、85%、100%乙醇中梯度脱水各2 min。自然晾干，加探针盖上盖玻片，封胶封片，78 ℃变性5 min，39 ℃孵箱杂交过夜。揭去盖玻片，46 ℃在2×SSC中洗5 min，46 ℃在2×SSC 0.1%的Np-40洗5 min，70%、85%、100%乙醇中梯度脱水各2 min，自然晾干。加DAPI复染，盖上盖玻片4 ℃保存。荧光显微镜油镜下选取分散较好的、完整的细胞分裂周期间期和中期分裂相细胞至少200个。结果判读：观察细胞核内荧光信号并计数，有2个荧光信号点为正常，多于2个信号点为扩增，仅见1个信号点为缺失。使用日本尼康80-A1荧光显微镜拍摄图像，使用图像分析软件AI（Gene Company Limited）进行分析。相关的滤色片包括：DAPI，ORANGE，GREEN，AQUA。

1.3 统计学处理方法 预后生存分析采用Mantel-Cox法构建生存曲线，采用Log-rank检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 本研究在150例MM患者中共检出超二倍体患者33例，发生率为22%。超二倍体患者年龄49～82岁，中位年龄66岁；男女性别比例9:2，其中28例为初发，5例为复发。23例为IgG型或IgG轻链型，5例为IgA轻链型，1例IgD轻链型。DS分期： I、II期45.5%（15/33），III期54.5%（18/33）；ISS分期：I、II期60.6%（20/33），III期39.4%（13/33）；RISS分 期：I、II期81.8%（27/33），III期18.2%（6/33）。对150例MM患者随访至2021年5月，超二倍体患者与非超二倍体患者（包括亚二倍体，二倍体及近四倍体）OS率差异无统计学意义（P=0.735），中位生存时间分别为18.5个月和15个月，见图1。

图1 超二倍体与非超二倍体MM患者OS

2．2 染色体核型分析 所示超二倍体均具备染色体三体性，常见增多的染色体按检出率从大到小依次为+5（23/33），+3（18/33），+19（17/33），+9（16/ 33），+2、+4、+7、+11（均13/33），+10（12/33）、+6、+14、+18、+21（均11/33），+8（10/33），具体染色体核型分布见表1和图2，与目前文献发现较常见增加的染色体大致一致，包括3、5、7、9、11、18、19和21号染色体[9-11]，但常见增加表达的15号染色体这里仅为5例，发生率为15.2%。图3为1例近四倍体MM患者R显带核型图，可见17、18、X染色体呈二倍体，1、10、11、12、13、14号染色体呈三倍体，2、3、4、5、6、7、8、9、15、16、19、20、21、22号染色体呈四倍体。

图2 超二倍体MM患者染色体增加构成与分布

图3 1例近四倍体MM患者骨髓染色体核型图

表1 患者核型特征

续表1

2.3 FISH检测结果 33例超二倍体MM骨髓标本用探针进一步行FISH检测，如图4所示检出异常有ABL信号扩增（20/33，60.6%），PML信号扩增（16/33，48.5%），1q21信号扩增（15/33，45.5%），RB1缺失（10/33，30.3%），CCND1扩增（8/33，24.2%），IGH扩增（3/33，9.1%），IGH易位（2/33，6.1%），C-MYC重排（2/33，6.1%），P53扩增（2/33，6.1%）。

图4 超二倍体MM患者骨髓FISH检测异常分布

2．4 复发超二倍体核型特征 在超二倍体MM患者中，有4例为复发患者，其中1例60个月中复发2次。初发时为二倍体，复发时为超二倍体，增加的三体有常见2、3、4、5、7、8、9、10、11、15、16、18、19、20、21号染色体。仅其中1例双轻链表达的MM初治为超二倍体，复发后表现为正常二倍体核型。见表2。

表2 4例复发超二倍体MM患者核型比较

3 讨论

染色体不稳定是MM的常见特征，细胞遗传学对预后的重要指导意义已达成共识，国际骨髓瘤工作组（International Myeloma Working Group, IMWG）在此基础上定义了高危患者。目前对CA的分析除传统的常规核型（conventional chromosome, CC）检测技术外，还有FISH、高通量基因组分析单核苷酸（single nucleotide polymorphism, SNP）、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）、基因表达分析技术等。本研究主要是以CC技术为基础，结合FISH检测，分析2009至2018年期间我院现存资料较完整的MM患者细胞遗传学异常情况。本研究发现提示预后较好的超二倍体在MM患者中较常见，且存在染色体三体性，同时往往合并多样的基因异常表达，包括基因扩增、易位及缺失等；但因样本量较少，故其对临床的指导意义相对有限。本研究患者为蛋白酶体抑制剂广泛应用前时期，故未将当前一线治疗方案疗效与CA的相关性进行探讨。

目前已有较多大样本研究对染色体数异常与MM预后的相关性进行探讨，认为超二倍体发生率较高，且提示较好的预后。对于超二倍体，认为其常见特征是一组一致的奇数染色体，染色体3、5、7、9、11、15、19和21的三体性在MM的发生率为50%～60%；而18号染色体在大多数情况下存在于二倍体中，其在超二倍体中以三体形式出现的情况很少 见[5，9，12-13]。近年YANG等[12]用FISH技术发现97例MM患者中40例为超二倍体，且以5、7、9、11、15和17号染色体三体的形式出现，而增加的染色体也与预后相关。超二倍体合并存在高危CA时则预后欠佳，如del（17p），t（4；14），+1q[14-15]。一项对1 970例初诊MM的随访研究发现，存在超二倍体或t（11；14）时，两者并不能改善同时具有不良预后事件MM患者的预后[如t（4；14），t（14；16），t（14；20）]，并且认为超二倍体发生于IGH易位事件前[16]； 但是另一项我国针对201例MM患者的细胞遗传学分析认为，超二倍体异常可改善具有高危细胞遗传学患者的不良预后，且仅有高危遗传学异常但不为超二倍体的患者预后最差[17]。另外较一致的观点认为亚二倍体异常提示不良预后，并且超单倍体是MM中一种新的高危细胞遗传学亚群[18]。而近四倍体发生率较低，且多合并染色体结构异常，及异常基因的表达，故其与预后的相关性有待进一步研究，但认为其预后不佳[16]，如本文中1例近四倍体患者，其OS仅为5个月。人们发现较其他类型染色体异常，具有染色体三体性特征的MM患者OS最佳，以+3，+5预后较好，+21预后相对较差，且予以RD（lenalidomide+dexamethasone）化疗疗效显著[19]。此外，本研究列出的4例复发MM患者中，3例初诊时染色体为二倍体，复发后染色体数为超二倍体，提示可能复发时患者的细胞遗传学表达较初发时更复杂，但这与患者预后的相关性仍需更多的临床数据支持。

本研究对象发病较早，蛋白酶体抑制剂可及性较差时期，故未对治疗进行探讨；另当时所及的CA检测技术有限，且样本量较小，故所得研究结论有一定的局限性，如相较超二倍体与非超二倍体的MM患者并未获得统计学差异的OS率。超二倍体患者所增加的三体染色体特征基本与文献报导一致，但其与MM患者的分期、分型及临床症状并未发现相关性。所增加的染色体往往合并多种基因的扩增性表达，通过进一步的FISH检测也发现了相关基因的异常表达，如所提示不良预后的1q21扩增，同时也有ABL、PML及CCND1扩增，但目前的研究仅提示上述扩增与染色体损伤修复相关，并无大样本的数据证明其在血液肿瘤中的预后指导意义。此外，RB1缺失也较常见，另外我们也发现了IGH易位与IGH扩增，但因总体样本量关系，并未将其与预后的相关性进行探讨。