吡格列酮对HaCaT细胞胰岛素抵抗的影响

李影，于宁，易雪梅，丁杨峰，高芸璐，陆家睛

（上海市皮肤病医院，上海 200443）

吡格列酮属于噻唑烷二酮类药物，是过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferatorsactivatedreceptors γ，PPARγ）的激动剂，不仅可以改善糖脂代谢，增加胰岛素敏感性；而且可以抑制细胞增殖，下调炎性反应[1]。近年来，临床研究发现吡格列酮可以改善银屑病患者的皮损症状[2-5]，但是，具体的机制尚不清楚。本文拟在体外采用不同浓度胰岛素诱导人永生化角质形成（HaCaT）细胞胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）模型，初步探讨吡格列酮对HaCaT细胞IR的影响。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞 HaCaT细胞，购于中科院细胞库。

1.1.2 实验药物 吡格列酮购于江苏德源有限公司。

1.1.3 试剂和仪器 DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；青霉素-链霉素混合液（Biotopped）；DMSO（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清（美国 ORIGIN公司）；胰岛素（北京索莱宝科技有限公司）；葡萄糖检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；CCK-8试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；96孔板（美国Corning公司）；AIRTECH超净台；IX71倒置显微镜（日本Olympus公司）；SC3610型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），酶标仪（Thermo Scientific）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HaCaT细胞冻存于液氮冷藏系统中，使用时取出进行传代培养。将取出的HaCaT细胞置于37℃的水浴中复苏，在超净台中将离心沉淀后的细胞装入含有DMEM高糖培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的细胞培养皿中。在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养，待细胞生长至70%～80%融合时进行消化和传代。

1.2.2 HaCaT细胞IR模型的建立 将胰岛素母液稀释为 10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L 5个浓度。取96孔板，将HaCaT细胞均匀接种于96孔板中，每列5个复孔作为一组，每组加入不同含浓度的胰岛素和正常组。培养时间分别为12、24、36和48 h。培养结束后按照葡萄糖测试盒说明书操作，于酶标仪中550 nm波长下检测各组OD值，根据公式计算出细胞的耗糖量。

1.2.3 吡格列酮对HaCaT细胞活性的影响 取处于对数生长期的HaCaT细胞，在显微镜下计数1×105个/mL细胞接种至96孔板，每孔加100 μL细胞混悬液。培养24 h，待细胞贴壁生长达到95%时，开始实验。实验分为正常组、实验组，实验组含不同浓度的吡格列酮（10、20、40、80、160 μmol/L）。36 h 后每孔加入含10%细胞计数方法（CCK-8）的培养基100 μL，避光培养1 h后用酶标仪在波长为450 nm下检测吸光度数据。

1.2.4 吡格列酮对IR HaCaT细胞葡萄糖消耗的影响 实验分为正常组（正常细胞＋培养基）、IR组（IR细胞+培养基）和实验组，实验组含不同浓度的吡格列酮（10、20、40、80、160 μmol/L）。待 80%HaCaT 细胞贴壁后，实验组、模型组加入含1×10-6mol/L胰岛素溶液的培养基，正常组加入不含胰岛素溶液的培养基，造模36 h后，对细胞进行12 h的饥饿处理，按照不同处理方法作用细胞培养24 h后，饥饿细胞8 h，每孔吸出2 μL培养基上清液加到新的96孔细胞培养板中，另加入2 μL标准对照品，再加入葡萄糖测试工作液（R1、R2等量）于 37°C、5.0%CO2培养箱中培养15 min，置于酶标仪550 nm下检测96孔板中上清液中的葡萄糖含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IR细胞模型 当胰岛素浓度为10-6mol/L，培养时间为36 h时，细胞的耗糖量最少，表明此时细胞对胰岛素的敏感性降低，产生了IR，见图1。

图1 10-6mol/L胰岛素不同作用时间下细胞葡萄糖消耗量

2.2 不同浓度吡格列酮对HaCaT细胞活性的影响 40 mol/L吡格列酮作用于细胞36 h，细胞存活率92.06%，见表1。

表1 不同浓度吡格列酮作用下细胞的存活率

2.3 不同浓度吡格列酮对IR HaCaT细胞葡萄糖消耗的影响 吡格列酮可以增加IR HaCaT细胞葡萄糖消耗，当吡格列酮浓度160 μmol/L，作用36 h时，作用最明显，见表2。

表2 不同浓度吡格列酮作用下IR HaCaT细胞葡萄糖消耗量 （±s）

表2 不同浓度吡格列酮作用下IR HaCaT细胞葡萄糖消耗量 （±s）

注：与正常组比较，*P＜0.001，与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.001。

组别 剂量（μmol/L） 葡萄糖耗糖量正常组 0 3.17±0.08模型组 0 2.26±0.06*吡格列酮浓度 10 2.32±0.04 20 2.35±0.03#40 2.52±0.04##80 2.68±0.08##160 2.79±0.09##

3 讨论

IR是指胰岛素对外周组织靶器官的作用减弱，葡萄糖摄取和利用效率降低，导致机体需要产生更多的胰岛素来维持代谢。多项研究包括笔者的前期研究均表明银屑病患者易于发生IR[6-8]。Karadag等[7]的研究显示银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）与IR之间有关联。Boehncke等[10]发现多个IR指标如肥胖指数、血管壁厚度、胰岛素分泌和脂肪细胞因子也与PASI有显著的相关性。Buerger等[11]研究表明IR不仅促进心血管合并症的发生，而且促进银屑病角质形成细胞的异常增殖和分化。上述研究证实银屑病发病与IR密切相关，而且IR能够影响角质形成细胞的稳态和银屑病的发病机制[12]。但是，IR影响角质形成细胞稳态参与银屑病发病的机制尚不清楚。因此，笔者尝试在体外构建IR角质形成细胞模型，以便用于今后IR影响银屑病发病机制的探讨。

本实验选取HaCaT细胞进行培养，通过不同浓度胰岛素刺激细胞，通过检测对比葡萄糖浓度变化，推测葡萄糖代谢情况。当胰岛素浓度为10-6mol/L，培养时间为36 h时，模型组葡萄糖消耗降低，提示IR HaCaT细胞模型构建成功。但是，目前关于诱导IR细胞的方法、药物的选择、作用浓度及时间都存在一定程度的差异，无法确定统一的标准，而且IR的效果也不稳定[13]。因此，将来需要进一步摸索诱导相对稳定的IR细胞模型的方法。

吡格列酮是噻唑烷二酮类药物，作用于脂肪、肌肉、肝脏等靶器官的PPARγ，增强组织对胰岛素的敏感性，改善IR。此外，吡格列酮可以抑制细胞增殖，下调炎性反应。临床研究中发现吡格列酮不仅可以改善银屑病合并代谢综合征患者的一些指标如空腹血糖、三酰甘油水平、收缩压、舒张压、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，而且减轻患者的疾病严重程度[14]。在银屑病患者中，吡格列酮可以降低白细胞介素（IL）-2、C-反应蛋白（CRP）等炎性因子的表达，减少皮肤炎性细胞的浸润[15]。本研究发现吡格列酮可以减轻HaCaT细胞IR，改善角质形成细胞稳态，为其治疗银屑病提供部分理论依据。但是，其治疗银屑病的机制仍需要深入探讨。

综上，本研究从体外细胞水平表明吡格列酮可以减轻细胞的IR。但是，本研究仅使用HaCaT细胞，未使用正常人表皮角质形成细胞（NHEK）。而且，关于吡格列酮改善IR的详细机制未做进一步探索，后续研究会进一步完善。