猪源乳酸菌的分离鉴定及安全性测定

袁翠平，马宇毅，张 碧，何竞铭，李 军

（广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室 530001）

自20世纪以来，人们在动物的饲料中添加抗生素，来预防机体感染疾病，促进动物机体的快速生长，提高饲料的利用率[1]。由于过度使用抗生素从而导致耐药菌的产生，致使动物机体免疫力水平下降，造成畜产品药物残留，危害人类健康，污染生态环境[2]。人们开始对绿色安全、无残留，可以有效替代抗生素使用的新型饲料添加剂重视[3]。随着抗生素替代品的不断开发和益生菌制剂的深入研究，获得性能优良的菌株十分重要。

乳酸菌是动物肠道中的正常微生物，在微生态制品当中的地位举足轻重，具有调节肠道环境，维持肠道内菌群平衡，为机体提供营养物质，促进生长发育，抑制腐败菌的繁殖，清楚腐败菌产生的垃圾，促进蛋白质等营养物质的吸收，提高免疫能力，保护动物机体健康的作用[4]，因此，乳酸菌制剂相关的研究具有十分重要意义。菌种的安全是乳酸菌制剂作为后续开发的前提。本研究从猪粪便内分离出一株乳酸菌，并对乳酸菌耐受性、耐药性、安全性等方面进行检测，为研制猪用益生菌制剂提供良好的材料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品

选用购自广西医科大学实验动物中心的昆明小鼠，体重约20g。

试验样品来自广西某养殖场健康猪群的新鲜粪便。

1.2 主要试剂及仪器

LB琼脂培养基、MRS培养基购自北京陆桥生物技术有限责任公司，革兰氏染色液、药敏纸片、生化鉴定试剂购自杭州滨河微生物制剂品有限公司，生理盐水本实验室自制，注射器购自北京康为世纪生物科技有限公司，电子天平购自于satorius公司。

2 方法

2.1 样品采集

取新鲜粪便约10g，置于无菌的三角烧瓶中，加入20 mL无菌MRS液体培养基均匀混和，1000 r/min离心10 min后，取上清液进行细菌分离。

2.2 细菌的分离鉴定

将上清液在超净工作台内按照10倍连续稀释，取各稀释度分别划线接种MRS培养皿上，37℃恒温培养48 h。挑取单个菌落，分别接种LB及MRS培养皿进行纯化培养，24 h后观察菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。

2.3 生理生化鉴定

将纯化好的菌种参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常用细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定。

2.4 乳酸菌的生物学研究

2.4.1 耐酸性试验

将分离菌（接种后分离菌浓度约为1×106CFU/mL）分别接种于pH值为2～8的MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h后，测定其OD600nm值。

2.4.2 耐胆盐性试验

将分离菌（接种后分离菌浓度约为1×106CFU/mL）分别接种于含牛胆盐0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h后，测定其OD600nm值。

2.4.3 耐热性能试验

将分离菌接种于MRS液体培养基活化（活化后分离菌浓度约为2×108CFU/mL）后，分别置于37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃共计6个温度梯度，在水中放置1h后，按照1∶200的比例分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h后，测定其OD600nm值。

2.5 16S rDNA测序鉴定

将纯化的菌株经PCR扩增后送苏州金唯智生物有限公司进行16S rDNA测序。

2.6 耐药性试验

采用NCCLS推荐的K-B纸片法，将纯化的菌株进行磷霉素、阿米卡星、大观霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素等24种药物做敏感性试验。

2.7 小鼠致病性试验

选用健康昆明小鼠30只，随机分为两组，分别为实验组和对照组，每组10只。实验组分为常规剂量组和高剂量组，常规剂量组按106CFU/mL灌胃，高剂量组按108CFU/mL灌胃，对照组灌入等量的生理盐水。一天一次，连续2周，观察记录小鼠的临床表现情况。

3 结果

3.1 形态特征及染色结果

纯化后的菌落为圆形，乳白色，表面光滑湿润有光泽、边缘整齐不透明边、凸起，容易挑起。通过革兰氏染色镜检可见，单个、成对或者成排的革兰氏阳性杆菌，无芽孢及鞭毛。符合乳酸菌的形态特征。

3.2 生理生化鉴定结果

按照《乳酸细菌的分类鉴定与实验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》对分离菌株进行生化试验，初步判断为乳酸杆菌，命名为G202005。

表1 生理生化试验结果

3.3 16S rDNA测序

经测序鉴定，与NCBI公布的唾液乳杆菌的同源性为97.6%，进一步证实分离的菌株为乳酸杆菌。

3.4 乳酸菌的生物学研究

菌株G202005在pH值2～8时均能生长，最适宜的pH值为5～7，表明菌株G202005有较强的耐酸能力。随着胆盐浓度的增加至0.40%，OD600nm值逐渐降低，但仍有细菌生长，说明菌株G202005有较强的耐胆碱能力。经70℃处理后，仍检出有细菌生存，说明菌株G202005有较强的耐热能力。

3.5 乳酸菌的耐药性测定

药敏试验结果显示，菌株G202005对四环素、多粘菌素甲氧嘧啶、复方新诺明、磺胺异亚唑、罗红霉素6种药物产生耐药性（表2）。

表2 耐药性试验结果

3.6 小鼠致病性试验

两组小鼠连续口服2周，健康状况良好，行为、生长、采食量和病理组织剖检均无明显异常，说明这株分离菌株对小鼠无毒害作用，安全的。

4 讨论

近年来，为了改善肠道内环境，丰富猪群胃肠道的菌群种类，提高猪群的生产性能，大力开发优质益生菌制剂。理想的益生菌菌株应该来自同源动物胃肠道中，从动物粪便中分离的菌株经过胃肠道的筛选，具有较强的耐受能力[5]。乳酸菌通常为分解植物和奶制品中发现的细菌，是国际公认的食品级安全微生物（GRAS），对人类、以及动植物的健康都有益[6]。可以调节畜禽肠道菌群结构，维持肠道菌群平衡。乳酸菌进入动物胃肠道后可以分泌产生多种酶和微量元素，促进畜禽对饲料的消化吸收，促进机体的生长发育[7]。乳酸菌也是免疫激活剂，可以刺激动物机体产生细胞免疫，使体液免疫和细胞免疫同时发挥作用，并且也可以提高免疫球蛋白在肠壁免疫细胞分泌的水平，从而提高动物机体的免疫力，保护机体健康[8]。乳酸菌产生的抑菌物质通常包括细菌素、有机酸、蛋白多肽类等，这些物质可以致使有害菌病菌裂解死亡，也可协同其他抑菌物质将病原菌杀灭，或者降低环境的pH从而抑制肠道有害菌的生长[9]。

本试验对健康猪群粪便中分离菌株形态学特性、生理生化、16S rDNA测序鉴定，通过药敏试验、小鼠致病性试验以及安全性评价，筛选出一株具有优良特性的乳酸菌，该菌具有耐热、耐酸、耐胆碱、安全无毒的特点，在猪饲料益生菌添加剂方面有潜在的应用前景。