盐霉素抗球虫机制及耐药性研究：概述*

孙 霈 毕菲菲 郝振凯 索 勋 刘贤勇

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

艾美耳属球虫感染造成的鸡球虫病可导致家禽死亡、生长不良和生产性能下降，严重危害集约化家禽养殖业(Blakeetal., 2020)。同时，球虫病还会增加其他病原的易感性。目前对于球虫病的控制以在饲料或者饮水中添加预防性抗球虫药为主，球虫病疫苗仍处于辅助角色(Clarketal., 2017)。盐霉素作为一类聚醚离子载体药物，因其具有抗球虫谱广、作用方式独特且不易产生耐药性等优势，在养殖业中得到广泛使用，但在该药上市4年后，各地相继报道耐药虫株的出现。本文将围绕盐霉素药理药化特性、作用机制及其抗药性研究等内容展开描述。

1 盐霉素的药理药化性质

1.1 药物理化性质

盐霉素属于聚醚离子载体类药物，本类药物是链霉菌属和其他种真菌的发酵产物。聚醚离子载体类药物具有很广的抗虫谱，对常见的6种鸡艾美耳球虫都有抗球虫活性，且该类药物具有作用方式独特、耐药性形成缓慢等优势，是目前广泛使用的一类抗球虫药物，该类药物包括莫能菌素，马杜拉霉素、盐霉素等(Antoszczaketal., 2019；Noacketal., 2019)。盐霉素(salinomycin)，又名沙利霉素，1968年首次由日本科研株式会社发现，是一种由白色链霉菌(Streptomycesalbus)ATCC21838菌株发酵的一元羧酸聚醚类抗生素，1981年，Kishi等人提出盐霉素全合成法(Antoszczaketal., 2019)。

盐霉素为白色或淡黄色结晶性粉末，稍有特殊臭味，难溶于水，易溶于有机溶剂，因此生产上多用其钠盐。盐霉素作为一种广谱抗球虫药，具有代谢快、残留少的特点，对革兰染色阳性菌、厌氧菌有效，还有促进畜禽生长的作用，但是该药安全范围窄，应该严格控制混饲浓度(苑兴辉, 2016)。若盐霉素药物在饲料中混合不均匀、使用时间过长或者与其他药物联合应用不当均会对机体产生毒性，引起动物采食量下降、体重减轻、共济失调等症状，因此了解药物的毒性以及机理对快速诊断与采取适宜的用药方案具有重要意义(周伟伟等, 2006)。

1.2 药物作用机理

各类聚醚离子载体类药物具有相似的作用机制，该类药物在化学结构上含有许多醚基以及一个一元有机羧酸，具有特殊的环状结构(图1)。在溶液中由氢链连接形成特殊结构，其中心由于并列的氧原子而带负电，能够发挥捕获阳离子的“磁阱”作用(Antoszczaketal., 2019)。

图2 盐霉素作用的可能机制Fig.2 The possible mechanisms of salinomycinA.盐霉素对癌细胞作用的可能机制(Zhou et al., 2013)；B.盐霉素抗球虫的可能机制(Abbas et al., 2011).A. The possible mechanisms of salinomycin action on cancer cell; B. The possible anticoccidial mechanisms of salinomycin.

图1 盐霉素的化学结构式Fig.1 Structural formula of salinomycin

几种聚醚离子载体类药物的作用机理不完全相同，其区别在于药物空间离子半径不同，因此对机体内不同离子的亲和力不同。盐霉素对钾离子具有偏好性，其次是钠离子和铯离子。跨脂质膜的金属阳离子梯度对于细胞存活具有重要的作用，保持“钾内钠外”的动态平衡与维持膜电位、细胞形状和几种重要的细胞途径正常运转密切相关(Kaushiketal., 2018)。Gupta等在药物筛选实验时发现，盐霉素能选择性杀伤乳腺癌的肿瘤干细胞，提示盐霉素有望成为新型抗肿瘤药物(Guptaetal., 2009)。在治疗癌症时，盐霉素能显著抑制肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡，对多种肿瘤均有明显的抑制作用(Zhouetal., 2013；黄龙等, 2016)(图2-A)。在抗球虫中，盐霉素作为预防类用药，对鸡球虫生活周期早期——子孢子入侵细胞后的发育阶段有高度的杀灭作用，对无性生殖的裂殖体有较强的抑制作用，其抗球虫峰期作用于感染后的第2 d(苑兴辉, 2016)。盐霉素通过与钾离子形成络合物，扰乱Na+/K+平衡，改变虫体内pH，导致虫体内渗透压升高，线粒体损伤，进而使虫体结构出现肿胀，能量过多消耗，最终导致虫体死亡(图2-B)(Chapmanetal., 2010；Antoszczaketal., 2019)。

2 盐霉素的使用及耐药性研究

2.1 盐霉素在养殖业中的应用

20世纪40年代，市场上抗球虫药的数量陆续增加。而在20世纪50年代，聚醚离子载体类药物就被发现，1974年，盐霉素获得抗球虫药专利(D'Alessandroetal., 2015)。盐霉素于1983年投入市场，由于其广泛的抗虫谱，该药迅速在各地区推广。在养鸡生产中，常使用其6%或10%的预混剂控制鸡球虫病，雏鸡混饲用药量为1 kg饲料中加60～70 mg，鸡用本品的休药期为5 d，本品禁用于产蛋鸡，亦禁止与地美硝唑、泰乐菌素、竹桃霉素、泰妙菌素并用(苑兴辉, 2016；田永民, 2019)。

表1 国内关于盐霉素抗药性流行病学调查Tab.1 Epidemiological investigation of salinomycin resistance in China

2.2 盐霉素耐药性研究

药物的使用，能够有效降低养殖业中因球虫感染带来的经济损失，但是随着药物的出现，各地区不断有耐药株的报道，这严重影响药物的有效性。因此，了解在各地区的流行情况以及其耐药性程度，为养殖业中正确选择高效的抗球虫药、制定合理的用药方案提供指导方案。利用测序技术，比较抗药株和敏感株基因水平及转录水平的差异，能够深入挖掘耐药性产生机制及药物作用机制等信息，以期为新药研发奠定基础。

2.2.1耐药株流行病学调查 20世纪40年代，市场上抗球虫药的数量陆续增加，聚醚类抗球虫药之所以发展迅速, 其原因之一是球虫对此类药物不易产生抗药性，然而随着时间的推移和使用量的增大, 球虫对聚醚类抗生素耐药的报道越来越多。盐霉素为产生耐药性最慢的聚醚离子载体类药物，但1989年美国学者Jeffers等人首次报道已在田间分离出盐霉素耐药株，之后不断有学者报道该类药物的耐药性(Abbasetal., 2011；Chapmanetal., 2015)。我国于1995年首次由汪明等从北京、天津、山东和广东等地10个用药史不同的鸡场分离的样品中检测到7/10的球虫株对盐霉素产生不同程度的抗药性，之后也有不同的学者利用抗药性指数，如最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)4项指标综合判定田间分离虫株的抗药性程度(表1)。也有相关学者发现，由于聚醚离子载体药物作用机理相似，该类药物之间易产生交叉耐药性。Raether等人就发现田间分离株对马杜拉霉素、盐霉素、莫能菌素以及拉沙里菌素有高度的交叉耐药性(Raetheretal., 1989)。

2.2.2药物诱导获得盐霉素耐药株：自20世纪50年代以来，通过实验室药物诱导球虫对某种药物产生耐药性是获得抗药株的方法之一。在实验室条件下，利用药物梯度递增诱导策略，即在低浓度条件下对敏感株进行诱导，待稳定后逐步提供药物浓度，经多次传代获得对药物推荐浓度(甚至更高浓度药物)产生耐药的虫株。据报道，不同学者已利用该策略获得不同药物的耐药虫株。盐霉素是一类耐药性产生极为缓慢的抗球虫药，王海霞等人以15 mg/kg为起始诱导浓度，经过连续10代诱导，最终获得对盐霉素工作浓度(60 mg/kg)抗药的球虫虫株(王海霞等, 2019)。

2.2.3盐霉素耐药机制研究现状：关于艾美耳球虫针对抗球虫药的耐药机制研究源于用遗传学方法推测的氟腺呤(arprinocid)耐药性相关机制(Shirleyetal., 2000)。时至今日，针对药物抗性机制的研究，球虫领域的相关研究多停留在比较耐药株与敏感株耐药指数、微观结构以及利用组学等技术研究蛋白质表达水平上的差异(Thabetetal., 2017)。目前，球虫领域对聚醚离子载体类药物抗药性的研究，大多学者多针对莫能菌素的耐药性进行探讨，而对于盐霉素多研究其抗性虫株的流行情况等内容。

马立农等(2010)通过比较耐药株与敏感株细胞膜流动性，认为球虫子孢子膜流动性降低可能是盐霉素失去抗球虫效果的直接原因。王海霞等(2020)人利用透射电子显微镜观察到耐药株的子孢子形态较之敏感株的出现肿胀且细胞膜不光滑，内外膜边界不清晰，微线体减少，细胞核形态不规则甚至溶解，部分细胞器结构不明显。耐药株与敏感株超微结构的研究为柔嫩艾美耳球虫球虫对盐霉素产生耐药的机制提供了基础。

挖掘盐霉素抗药性位点，深入解析抗性机制，需要从全基因角度出发，研究抗性相关基因以及基因表达水平。随着高通量测序技术的迅速发展，顶复门原虫中疟原虫领域相继解析喹啉、常山酮、青蒿素等药物作用位点，并利用基因编辑技术从分子层面阐明抗性机制，这为球虫领域研究药物抗性机理提供方向。转录组学的研究能从整体水平研究耐药株及敏感株基因表达差异，以揭示特殊生物学过程。2020年王海霞等通过转录组测序发现敏感株与耐药株子孢子相比，有17个基因表达上调以及13个基因表达下调，其中α淀粉酶(ETH_00004695)以及ABC转运蛋白(ETH_00012930)基因在耐药株中表达上调，转座子Tf28多聚蛋白(ETH_00031285)表达下调(王海霞, 2020)。抗性基因的挖掘是我们解析抗性机制以及研发新药的基础，由于基因组测序分析的成本大大降低，基于实验性进化结合高通量基因组测序和分析而衍生出进化和重测序技术，作为研究表型和基因型之间对应关系的强大工具，已成为研究遗传和进化的一大利器。聚醚离子载体类药物作为一类抗生素药，对抗革兰氏阴性菌以及癌症方面都有重要的作用。在粪肠球菌的抗药性研究中，利用比较基因组学比较耐药株和敏感株，发现基因上存在5.9 kb区域的差异，该区域包括两个编码ABC型转运蛋白的基因，分别是“ABC转运蛋白渗透酶蛋白”和“ABC型多药转运系统ATPase组分”(Nilssonetal., 2016)。在癌症方面的研究发现，连续使用盐霉素作用于细胞，会使细胞产生稳定的耐药性，使ABC转运蛋白表达的上调，外排泵的上调减少了细胞内药物的积累并增加了耐药性(Hermawanetal., 2016)。

3 展望

盐霉素作为一类抗球虫药，其耐药性的问题会明显降低该药的抗球虫效率。因此，球虫耐药性的研究应该更多涉及分子层面以及机制的探讨，这是球虫领域相对空白的地方。利用现代生物信息学技术阐明盐霉素的作用机理，解释该药产生耐药性机制，挖掘药物作用靶点，能够弥补现在球虫耐药性领域研究的空白，也将为之后研发新的抗球虫药奠定基础。