我国不同地域蜱类自然感染MIV-2病毒的调查*

李 洁 王 倩,2 夏珞媛,2 潘育生 贾 娜** 曹务春**

(1.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；2.山东大学公共卫生学院，济南 250000)

蜱类能够传播细菌、病毒、立克次体等病原体(Firthetal., 2014; Chengetal., 2016; Diuk-Wasseretal., 2016; Leeetal., 2016)，是人类和动物疾病的重要传播媒介(Dantas-Torresetal., 2012)。位于我国西南地区的云南、贵州省和重庆市是重要的虫媒疾病疫源地之一，其适宜的气候和独特的地形特征适合蜱类生长繁殖，比如硬蜱属Ixodes、花蜱属Amblyomma、血蜱属Haemaphysalis、扇头蜱属Rhipicephalus、璃眼蜱属Hyalomma和革蜱属Dermacentor等(Wuetal., 2018)。黑龙江和吉林省位于东北地区，该地区野生动物植物资源丰富也是蜱媒传染病的重要自然疫源地之一，常见主要蜱种有全沟硬蜱Ixodespersulcatus、森林革蜱Dermacentorsilvarum、日本血蜱Haemaphysalisjaponica、嗜群血蜱Hae.concinna等(Yuetal., 2015)。广西省位于华南地区，气候类型多样、雨热资源丰富，为山地丘陵性盆地地貌，孳生蜱类繁多，嗜龟花蜱Amblyommageoemydae、龟形花蜱Am.testudinarium等少见蜱种分布其中(Jongejan and Uilenberg,2004; de la Fuenteetal., 2017)。这些蜱类及其可能携带的病原体监测是开展该地区蜱媒疾病防控的重要基础。

楚病毒(chuvirus)属于楚病毒目(Chuviridae)楚病毒科(Chuviridae)，楚病毒科病毒可感染多种无脊椎动物宿主，包括甲壳类、线虫纲、昆虫纲、多足纲、蛛形纲和伊克虫纲(Niuetal., 2020)。随着宏转录组学的发展，学者在湖北武汉的微小扇头蜱中首次发现了Wuhan Tick virus 2 ，(WHTV2)(Lietal., 2015)。此后有研究表明，在法国(Gondardetal., 2020)、巴西(Maruyamaetal., 2014)、特立尼达和多巴哥(Sameroffetal., 2019)、泰国(Temmametal., 2019)的微小扇头蜱中均检测出此病毒。本研究采集了我国西南西区、东北地区、华南地区的不同蜱种，根据我们获得的MIV-2全基因组序列，发现其与目前发现的Wuhan Tick virus 2的同源性为94%，MIV-2与WHTV2是同一类病毒的不同株，利用前期建立的MIV-2特异性检测的荧光定量PCR检测方法(李洁,2020)，开展了MIV-2流行率的调查。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2017—2019年，采用布旗法采集我国广西、云南、辽宁、贵州、黑龙江、吉林省和重庆市活跃季节游离蜱(图1)。所有蜱均经形态学鉴定到物种水平，编号后于-80 ℃保存。

图1 蜱标本采集点分布Fig. 1 Distribution of collection points for tick specimens

1.2 主要试剂和仪器

实验试剂：All Prep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)、One Step Prime ScriptTMRT-PCR Kit(大连宝生物工程)、RNase I(Thermo Fisher)、无菌去离子水(索来宝)、无水乙醇(振誉生物科技有限公司)等。实验仪器：超净工作台(NUAIRE)、Light Cycler 480Ⅱ(Roche)、微量移液器(Eppendorf)、涡旋振荡器(Bencmark)、体式显微镜(Leica)、组织研磨仪(上海净信)、离心机(SIGMA)、恒温水浴箱(长风)和研钵(上海化科实验器材公司)等。

1.3 样品处理及核酸提取

蜱样品：将研钵高压消毒烘干，然后用液氮进行预冷，将蜱从人工气候箱或-80 ℃冰箱中取出放入研钵后于冰盒中快速研磨，研磨4次，后常温放置大约5 min，以防止加裂解液后冻住；将蜱研磨成匀浆为止。核酸提取按照Qiagen DNA/RNA提取试剂盒的说明书进行。

1.4 病毒筛查

MIV-2为环状，包含4个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)的病毒。通过前期针对其中的病毒依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)建立的检测方法合成引物(李洁, 2020)，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列、扩增片段长度详见表1。采用一步法逆转录荧光定量PCR进行试验。将拷贝数最低且稳定的Ct值定为检测阈值。本实验检测阈值定于Ct<35(100拷贝数/μL)。在不同房间进行反应体系的配置与PCR扩增，以防污染。

表1 病毒实时荧光定量 PCR引物信息Tab.1 Primers for virus detection with RT-qPCR

2 结果

2.1 标本筛查结果

结果共采到614只蜱虫(表2)，涉及15个蜱种，所有蜱虫全部是游离成蜱，对全部蜱虫进行核酸提取后进行MIV-2检测，检出携带MIV-2的阳性样本67个，总阳性率为10.91%，部分结果见图2。

表2 蜱标本基本信息Tab.2 Basic information of tick specimen

2.1.1不同地域蜱携带MIV-2情况：各省市检测阳性率从高到低依次为云南、辽宁、贵州、重庆、广西、吉林、黑龙江。其中MIV-2在云南和辽宁阳性率均为20%以上，说明蜱中携带的MIV-2在这两个省占优势(表3)。

2.1.2不同蜱种携带MIV-2情况：本研究共检测蜱种15个，分别是粒形硬蜱I.granulates、微小扇头蜱Rh.microplus、卵形硬蜱I.ovatus、龟形花蜱Am.testudinarium、猛突血蜱Hae.montgomeryi、长角血蜱Hae.longicornis、嗜群血蜱Hae.concinna、森林革蜱D.silvarum、日本血蜱Hae.japonica、全沟硬蜱I.persulcatus、爪哇花蜱Am.javaense、嗜龟花蜱Am.geoemydae、镰形扇头蜱R.haemaphysaloides、草原革蜱D.nuttalli、豪猪血蜱Hae.hystricis，在粒形硬蜱、微小扇头蜱、卵形硬蜱、龟形花蜱、猛突血蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱8种蜱种中检测到MIV-2。证实MIV-2可以由多蜱种携带，由于样本量有限，虽然并未在日本血蜱、全沟硬蜱、爪哇花蜱、嗜龟花蜱、镰形扇头蜱、草原革蜱、豪猪血蜱中检测到MIV-2，但并不排除其携带MIV-2(表4)的可能性。

表3 不同地域蜱携带MIV-2 阳性率结果Tab.3 The positive rate of ticks carrying MIV-2 in different regions

图2 部分实时荧光定量 PCR结果Fig. 2 Part results of RT-qPCR A：阳性结果；B：阴性结果。A: The positive result; B: The negative result.红色: 阳性结果；绿色：阴性结果。Red: The positive result; Green: The negative result.

表4 不同蜱种携带MIV-2感染率结果Tab.4 Infection rate of tick species infected by MIV-2

3 讨论

蜱是人类和动物病毒的重要媒介，目前研究发现160余种病毒是由蜱传播的，约25%的蜱传病毒与疾病有关(Kazimírovetal., 2017)。在我国能导致严重疾病的蜱传病毒主要有非洲猪瘟病毒(African swine fever virus ，ASFV)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)、克里米亚—刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)以及原发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)(Yuetal., 2015)。然而，目前对蜱传病毒多样性的了解十分有限(Tokarzetal., 2014, 2018)。本研究采集了我国7个省、市、15个蜱种，其中黑龙江采集的硬蜱属、血蜱属标本数量较多，这与赵国平等人的地理预测研究一致(赵国平,2018)，本研究蜱类标本来源广泛，蜱种较为丰富，对蜱传病毒的媒介和传播研究有一定指导意义。

楚病毒(chuvirus)属于楚病毒科(Chuviridae)荆楚病毒目(Jingchuvirales)，可能是至今发现的第1个可以自主复制环状RNA病毒，有研究表明，节肢动物中携带此类病毒，其致病性仍不清楚(Wangetal., 2019)。MIV-2属于chuvirus，为环状RNA病毒，近年来在世界多地中发现同类楚病毒(Lietal., 2015; Gondardetal., 2020)，但其媒介、宿主和致病性研究仍较缺乏。为此，本研究以一步法逆转录荧光定量PCR检测结果为依据，对我国云南、贵州、辽宁、黑龙江、吉林、广西和重庆的蜱类标本携带的MIV-2情况进行了调查，样本总阳性率为10.91%，其中，MIV-2在云南和辽宁阳性率较高，分别为30.00%和20.83%。本研究共检测蜱种15种，在粒形硬蜱、微小扇头蜱、卵形硬蜱、龟形花蜱、猛突血蜱、长角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱中均检测到MIV-2，张永振等亦发现微小扇头蜱中WHTV2的存在(Lietal., 2015)，MIV-2与WHTV2是同一类病毒的不同株，可见，MIV-2可感染多个蜱种，至于这些是否具备传播楚病毒的能力以及这些楚病毒对人类致病性仍需进一步研究。

鉴于相同的叮咬吸血特征，多种蜱类具有复合感染多种病原体的潜能，因而，携带MIV-2的蜱种也可能同时可携带其他致病病原体，如伯氏疏螺旋体、无形体，立克次体、SFTSV等(周明浩等, 2019)，这些病原体的感染是否与MIV-2相关还有待进一步研究。MIV-2在这些蜱种中自然感染的发现对于探讨相关蜱媒疾病发生和预防具有重要理论和现实意义。