葡萄糖亚适量流加对谷氨酸棒杆菌产 L-异亮氨酸的影响

熊海波，刘景阳，徐庆阳,2,

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457）

L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一，L-异亮氨酸用途广泛，是人体激素、蛋白质合成和能量生成的原料，能促进蛋白质合成并抑制其分解[1-4]； 随着人们对L-异亮氨酸认知越来越全面，其在饲料、食品、医药等领域的应用越来越广泛[5-7]。

产酸率及菌种活力是评价发酵能力的重要指标，因此随着对L-异亮氨酸的深入研究，具有原料成本低、发酵条件温和、发酵能力稳定的的谷氨酸棒杆菌发酵法逐渐成为生产L-异亮氨酸的主要方式[8-10]。而发酵能力不仅取决于发酵培养基的选择，更取决于发酵方法的控制，这包括多尺度发酵过程控制技术、超声辅助发酵技术、循环发酵技术、半连续发酵技术等。目前L-异亮氨酸发酵方法主要采用低残糖流加工艺，而这种方法主要面临糖酸转化率低、发酵溶氧供应不足、副产物积累过多等问题，进而导致发酵周期缩短以及L-异亮氨酸提取困难[11-12]。

本研究通过分析菌体发酵不同阶段对葡萄糖需求能力的不同，采用多阶段葡萄糖控制工艺，即将菌体分为适应期、对数生长期、产酸高峰期及衰亡期4 个阶段，对菌体摄糖能力的差异进行精准调控，实现菌体的“发酵转换”[13]，将发酵工艺精细化、合理化，达到发酵产酸的最优条件。这种方法不仅解决菌体适应期长、产酸高峰期短、菌体提前进入衰亡期等问题，还可有效降低能源消耗、提升发酵液质量，为后续的产物提取降低 难度[14]。同时应用代谢流分析原理测定胞外的产物浓度，计算菌体稳定期各途径的反应速率，得到代谢流量分布，并对流量分配进行对比与分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YILM1504，由天津科技大学代谢工程实验室保存。

1.1.2 培养基与试剂

种子培养基配方：葡萄糖30 g/L，豆粕粉10 g/L，酵母粉8 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米浆5 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.1 mg/L，赖氨酸1 g/L，蛋氨酸1g/L，谷氨酸1g/L，消泡剂0.2 g/L，用NaOH溶液调节pH 4.5～5.0，种子发酵罐培养用氨水调节并维持pH 6.7～7.0。

发酵培养基配方：葡萄糖60 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41.5 g/L，玉米浆5 g/L，VB11 g/L，蛋白胨2 g/L，豆饼水解液10 mL/L，赖氨酸1 g/L，蛋氨酸0.3 g/L，谷氨酸3 g/L，甜菜碱0.3 g/L，用NaOH溶液调节pH 4.5～5.0，发酵罐培养用氨水调节并维持pH 6.7～7.0。

葡萄糖 山东西王药业公司；玉米浆 内蒙古阜丰生物科技有限公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZH-100KBS型全自动立式蒸汽灭菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自动控制发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；SBA-40E生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；KQ-C高压蒸汽发生器 上海奉贤协新机电厂；752分光光度计 上海分析仪器厂；生物显微镜 日本Olympus会社。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养

谷氨酸棒杆菌YILM1504在－80 ℃条件下保存在20%的甘油管中，接种于斜面试管活化24 h，再从斜面取2 环一代活化菌种接种于200 mL茄形瓶固体斜面培养20 h。

5 L种子发酵罐，罐体灭菌后，定容种子菌种培养基2 L，接种，温度32 ℃，pH值维持在6.7～7.2之间，培养至菌种量OD600nm为20×0.8时接发酵。初始通风 2.0 L/min，初始罐压小于0.05 MPa，初始转速200 r/min，罐内溶氧保持在30%～40%之间。一般种子培养时间为

14～16 h。

5 L发酵培养，罐内留800 mL种子液，再接入2.2 L发酵培养基，定容到3 L，进入发酵产酸培养。温度32 ℃，pH 6.7～7.0，溶氧保持在30%～40%之间，转速由 200 r/min逐步提加到930 r/min；通风由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min，后根据溶氧变化逐步降低转速与通风。16 h后测残糖，流加800 g/L的葡萄糖，维持罐内残糖在0～20 g/L之间。中间添加适量消泡剂消除泡沫。

1.3.2 分析检测

1.3.2.1 高效液相色谱法检测L-异亮氨酸及副产物

发酵液中检测到除L-异亮氨酸外多种副产物，需要配制多梯度浓度L-异亮氨酸和副产物标准品。发酵液中L-异亮氨酸和副产物浓度用高效液相色谱法测定。采用Agilent C18色谱柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm），衍生剂为2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流动相为50%乙腈、 4.1 g/L乙酸钠溶液，柱温33 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm[15]。

1.3.2.2 pH值的测定

采用pH 6.4～8.0精密pH值试纸测定。

1.3.2.3 葡萄糖含量检测

每2 h取样，离心，留上清液。用SBA生物传感分析仪检测葡萄糖含量。

1.3.2.4 菌体生物量检测

每隔2 h取样，分别稀释10、20、100、200 倍，用紫外-可见分光光度计测量样品在600 nm波长处OD值。OD值范围在0.2～0.8，超过量程后需换下一个稀释倍数。菌体生物量计算如式（1）所示：

1.3.2.5 pH值在线检测

发酵罐自带梅特勒pH值在线检测，用pH值试剂进行放液验证检测。培养基pH值控制可用梅特勒电导率仪精密检测。

1.3.2.6 溶氧测定

发酵罐自带瑞士哈美顿VisiFerm DO电极，溶氧校正，0点是饱和亚硫酸钠溶液中的稳定值，100%点是发酵液灭菌后的冷却溶液中稳定值。

1.3.3 指标计算

1.3.3.1 糖酸转化率计算

糖酸转化率计算[16]如式（2）所示：

式中：ρ为L-异亮氨酸质量浓度/（g/L）；V为发酵液总体积/L；m为总耗糖量/g。

1.3.3.2 最大补糖速率计算

在流加葡萄糖过程中，达到最大补糖速率表现方式是，发酵控制器中溶氧曲线围绕着某个定值上下波动，其原因是流加葡萄糖随蠕动泵打入发酵罐内，存在一个蠕动速率（如12/1，表示蠕动泵关12 s，转动1 s），在蠕动期间，葡萄糖进入罐内，溶氧下降，当停止蠕动，随着加入的葡萄糖逐渐消耗，溶氧逐渐上升，如此反复，溶氧曲线波动前进。此时葡萄糖对菌体供给平衡，电子天平上补料瓶葡萄糖减少量为期间菌体刚好消耗葡萄糖的量，此时补糖速率为最大补糖速率。再增大补糖速率，也不会增加菌体耗糖速率，多余补充的葡萄糖以罐内残糖形式存在，甚至会增加发酵液黏稠度与渗透压，降低菌体活力，减弱葡萄糖吸收能力。通过实时计算不同时期补糖速率，绘制补糖速率曲线。

最大补糖速率计算如式（3）所示：

式中：m1为单位时间耗糖量/g；t为单位补糖时间/h；V1为实时发酵液体积/L。

1.3.4 代谢流网络建立

采用Vallino等[17]的方法，根据物料平衡计算代谢物的积累速率，如式（4）所示：

式中：xj（t）为第j步反应的反应速率/（mmol/（L·h））；xk（t）为第k步反应的反应速率/（mmol/（L·h））；aj为第j步反应的反应计量系数；ak为第k步反应的反应计量系数；rj（t）为中间代谢物j的积累速 率/（mmol/（L·h））。

由拟稳态假定可得rj（t）＝0。代谢网络中的m个中间代谢物构成n个代谢流平衡方程式，写成矩阵形式见式（5）：

式中：A为m×n维矩阵；x（t）为n×1维矩阵；n为选定的速率总数目。待解决问题自由度见式（6）：

建立代谢网络原则[18]：1）细胞处于非生长时期或细胞浓度变化不大而可以忽略；2）细胞代谢中不存在乙醛酸循环；3）还原型辅酶II（NADPH）供需平衡，即反应途径中消耗的NADPH与磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，HMP）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环产生的NADPH总数相等；4）不考虑ATP总量平衡；5）反应过程中无分支节点的反应按一步反应计算。

1.4 数据处理

所有实验数据取3 次实验的平均值。单因素方差分析之后Dunnett-t检验确定数据差异的显著性（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 初始葡萄糖添加量对L-异亮氨酸发酵的影响

2.1.1 初始葡萄糖添加量对菌体生长及L-异亮氨酸产量的影响

分别向发酵培养基中添加30、60、90、120 g/L的初始葡萄糖，以初始葡萄糖添加量30 g/L为对照组，考察初始葡萄糖添加量对菌体生物量及L-异亮氨酸等发酵参数的影响，结果如图1所示。

图1 初始葡萄糖添加量对菌体生物量及L-异亮氨酸合成的影响Fig. 1 Effects of different initial glucose concentrations on bacterial biomass and L-isoleucine synthesis

随着底物葡萄糖添加量的提升，菌体生长速率加快，底物葡萄糖添加量为90 g/L时，菌体生长速率最快，生物量最高，OD600nm达到129，L-异亮氨酸达到 37 g/L，但继续增加底物葡萄糖添加量，对谷氨酸棒杆菌菌体生长产生一定的抑制作用，且底物葡萄糖添加量越高抑制作用越强[19]。同时谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸为生长偶联型，高生物量有利于产酸速率的提升，菌体生物量与产酸分别比对照组提高了24%和24.8%。

2.1.2 初始葡萄糖添加量对糖酸转化率及补糖速率的影响

如图2所示，以30 g/L初始葡萄糖添加量为对照组，考察初始葡萄糖添加量对起始补糖时间、过程补糖速率及糖酸转化率的影响。

图2 初始葡萄糖添加量对糖酸转化率及补糖速率的影响Fig. 2 Effect of initial glucose concentration on glucose-to-acid conversion rate and glucose feeding rate

在发酵初期种子刚接入发酵罐时，菌体处于适应期，以适应新的环境，初始葡萄糖添加量造成的发酵液环境差异会对新生菌体的生长造成影响。一方面提升初始葡萄糖添加量会增加发酵液黏稠度以及胞外渗透压，造成罐内氧传递能力下降及菌体抵抗外界环境刺激难度上升；另一方面提升初始葡萄糖添加量会使菌体长时间处于葡萄糖过量状态，补糖时间延后，从而推迟菌体进入葡萄糖供需平衡状态[20]。

由图2可知，随着初始葡萄糖添加量的增加，补糖时间逐渐延后，60、90、120 g/L初始葡萄糖发酵补糖时间分别比对照组推迟了2.6、4.5、5.6 h，其中90 g/L的初糖发酵补糖速率最高峰为8.3 g/（L·h），分别比其他底物葡萄糖添加量提前了6、2、8 h，最高峰补糖速率分别提升了13.2%、6.0%和15.7%。菌体耗糖速率与菌体产酸速率共同决定了糖酸转化率的大小，由图2可知，90 g/L初始葡萄糖发酵产酸时间最早，糖酸转化率最高，且最高糖酸转化率达到了23.2%，平均糖酸转化率为19.6%。

2.1.3 初始葡萄糖添加量对产酸影响

发酵结束后对主要副产物缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸最终含量进行检测，结果如图3显示，研究表明90 g/L 的初始葡萄糖发酵总产物（L-异亮氨酸+缬氨酸+亮氨酸+丙氨酸）、主产物（L-异亮氨酸）、副产物（缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸）都达到了最高，其L-异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸产量分别为37、6.7、4.3、3.7 g/L，比对照组分别提高了24.6%、34.0%、34.3%、32.1%。谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的同时，副产物也会协同增长，且副产物随着L-异亮氨酸增多而增多，这为后续发酵提取与产品纯化带来困难[21]。

图3 初始葡萄糖添加量对L-异亮氨酸及副产物的影响Fig. 3 Effect of initial glucose concentration on production of L-isoleucine and by-products

2.2 葡萄糖亚适量流加工艺对L-异亮氨酸的影响

2.2.1 最大补糖速率与葡萄糖亚适量流加工艺对比

当葡萄糖流速率正好与菌体耗糖速率相等时为最大补糖速率，表观表现形式为发酵罐显示器中实时溶氧曲线围绕一个定点波浪前进，微观表现形式为用SBA生物传感分析仪检测发酵上清液显示葡萄糖质量浓度不大于0.2 g/L（理论发酵上清液葡萄糖含量为0，但流加的葡萄糖不会被瞬时消耗，有一个消耗过程，会显示0.2 g/L延迟误差）。其最大补糖速率见图4，为 0（0～8 h）、6.00～8.30（8～14 h）、8.30～7.78（16～24 h）、7.78～5.58 g/（L·h）（24～40 h）。

图4 葡萄糖亚适量补糖工艺的补糖速率曲线Fig. 4 Suboptimal glucose feeding rate curves with different peak feeding flow rates

在初始葡萄糖添加量提高到90 g/L的基础上，以最大补糖速率为对照组，分别依次降低补糖速率为最大补糖速率的90%、80%、70%作为实验组，探究葡萄糖亚适量补糖工艺对菌体生长及产酸的影响。最大补糖速率的90%葡萄糖亚适量动态补糖速率为 0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）。

2.2.2 葡萄糖亚适量流加工艺对菌体生物量及产酸的影响

由图5可知，在以最大补糖速率发酵培养32 h后，菌体死亡率大于存活率，菌体生物量下降，但在3 组葡萄糖亚适量补糖策略下，发酵后期，菌体生物量一直缓慢增长，菌体活力旺盛[22]。由菌体生长曲线可知，0～20 h，饱和葡萄糖消耗有利于菌体生长，以最大补糖速率发酵生物量增长最快，20 h后，最大补糖速率发酵比生长速率负增长，而90%最大补糖速率发酵菌体比生长速率不变，菌体生物量反超，OD600nm达到了146，比最大补糖速率发酵最高菌体生物量高了13.26%，最终菌体量提高了30.32%。由L-异亮氨酸过程增长曲线可知，随着补糖速率的降低，菌体产酸量逐渐上升，最终在90%最大补糖速率下达到了最高，为43.0 g/L；因此，略低的补糖速率有利于菌体产酸，但过低的补糖速率制约L-异亮氨酸的生成，由产酸曲线可知，亚适量补糖工艺产酸量分别比对照组提升了16.02%、11.12%、0.05%。

图5 葡萄糖亚适量流加工艺对菌体生物量及产酸的影响Fig. 5 Effects of suboptimal glucose feeding on bacterial biomass and acid production

2.2.3 葡萄糖亚适量流加工艺对副产物生成的影响

谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸中副产物缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸较多，且随着发酵时间推移不断增长，超出菌体耐受水平，对发酵造成不利的影响。缬氨酸、亮氨酸与L-异亮氨酸同为分支链氨基酸，共用多种脱水酶、转氨酶，产酸协同。图6为最大补糖速率下副产物过程曲线，发酵16 h后，缬氨酸、亮氨酸同时产生，前期增长迅速，后期略微减慢，结束时分别达到了6.72、 4.33 g/L；丙氨酸从发酵开始就不断增长，且随着时间推移，产酸速率逐渐上升。分析发现，以最大补糖速率发酵，3 种副产物氨基酸较多，且随着时间推移都不断增长，不利于长时间发酵，发酵时间的缩短会导致发酵周期短，L-异亮氨酸产量低，但发酵时间延长，副产物氨基酸增多，转化率下降，提取困难，不利于产品商业化竞争[23]。

图6 最大补糖速率下副产物速率曲线Fig. 6 Byproduct production at maximum glucose feeding rate

由图7可知，最大补糖速率由100%降低至70%，各副产物氨基酸积累都有小幅下降。90%、80%、70%最大补糖速率对比对照组缬氨酸分别下降了40.05%、52.22%、66.46%，亮氨酸分别下降了40.17%、52.35%、66.22%，丙氨酸分别下降了50%、65%、20%。从发酵控制方面使副产物氨基酸的生成减少，能达到代谢流迁移的目的，从而增大合成异亮氨酸的代谢流[24]。

图7 葡萄糖亚适量工艺产副产物缬氨酸（a）、亮氨酸（b）、 丙氨酸（c）的过程曲线Fig. 7 Time-course curves of production of by-products including Val (a), Leu (b) and Ala (c) with suboptimal glucose feeding at different peak feeding rates

2.3 葡萄糖添加量与葡萄糖亚适量工艺的协调

为协调菌体生物量与开始产酸时间对菌体产酸能力的影响，通过调节初始葡萄糖添加量达到提前进入产酸期的目的，对初始葡萄糖添加量进一步微调。由图8可知，在一定范围内，随着底物葡萄糖添加量的上升，菌体生长速度加快。在发酵40 h后，菌体OD600nm分别达到了130.32、140.25、146.21、153.32，这表示初期高质量浓度初始葡萄糖有利于菌体的生长；由产酸速率可知，在一定范围内，随着初始葡萄糖添加量的下降，产酸速率逐渐上升，从100 g/L的底物葡萄糖降到80 g/L发酵，最终产酸达到44.32 g/L，提高了5.53%。

图8 90%最大补糖速率下不同初始葡萄糖添加量对菌体生物量及 L-异亮氨酸产量的影响Fig. 8 Effects of different initial glucose concentrations on biomass and L-isoleucine yield at glucose feeding rate equal to 90% of maximum feeding rate

谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸采用高质量浓度初始葡萄糖发酵，能够提高设备利用率，中后期采用葡萄糖低速流加工艺，可降低渗透压，使细胞代谢稳定，有利于菌体生长和代谢产物分泌，特别是对高生物量发酵工艺，能提高氧的传递速率，提高溶氧水平[25]。

2.4 葡萄糖亚适量工艺对L-异亮氨酸合成及关键节点的代谢流的影响

以最大补糖速率发酵为对照组，90%最大补糖速率为优化组，对比理想代谢流，分析胞内各途径代谢流变化。

2.4.1 6-磷酸-葡萄糖节点代谢流分析

如图9a所示，葡萄糖进入糖酵解（Embden- Meyerhof-Parnas，EMP）途径的代谢流为64，比对照组降低了9.28%；进入HMP途径的代谢流为36，比对照组提高了19.63%，是理论最大值的36%，葡萄糖经HMP和EMP的代谢流之比为0.56。HMP产生的磷酸戊糖全部转化为EMP途径中的中间产物，同时为氨基酸的合成提供大量的还原力NADPH，因此提高HMP和EMP的代谢流之比有利于氨基酸的合成[26]。

图9 L-异亮氨酸代谢流节点分析Fig. 9 Analysis of metabolic flow nodes for biosynthesis of L-isoleucine

2.4.2 丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸节点代谢流分析

磷酸烯醇式丙酮酸通过CO2固定反应生成草酰乙酸，而草酰乙酸是合成其他氨基酸的前体，图9b中，有34.5的磷酸烯醇式丙酮酸通过CO2固定反应形成草酰乙酸，所以有必要增强TCA循环的回补途径增强L-异亮氨酸的合成。丙酮酸节点是一关键节点，几种氨基酸的合成以及TCA循环均需丙酮酸的直接或间接参与。因此，改变丙酮酸节点外的代谢流分布，使代谢流向L-异亮氨酸的合成方向迁移对高产L-异亮氨酸具有重要意义[27-29]。从图9b可以看出，优化组丙酮酸流向主代谢途径乙酰辅酶A代谢流108.6，比对照组增强了4.1%，流向其他途径的代谢流，如α-乙酰乳酸、丙氨酸、α-酮异戊酸代谢流分别为38.2、3.0和3.7，比对照组减弱了5.9%、33.3%和69.2%。

2.4.3 苏氨酸节点代谢流分析

如图9c所示，苏氨酸作为L-异亮氨酸的直接前体，优化组天冬氨酸进入苏氨酸的代谢流比对照组增强了18.92，并全部流向L-异亮氨酸的生成，无苏氨酸流出。由于TCA循环的回补途径的增强，直接导致下游途径生成天冬氨酸增强，有利于L-异亮氨酸的积累。

2.4.4 天冬氨酸节点代谢流分析

由于L-异亮氨酸的6 个碳原子中的4 个碳原子来自于天冬氨酸，同时L-异亮氨酸与苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸一起被称为天冬氨酸族氨基酸，所以有必要增强天冬氨酸的来源[30]。优化组天冬氨酸进入苏氨酸的代谢流为34.5，比对照组增强了20.62%，并全部流向苏氨酸的合成，无缺陷物质赖氨酸积累。

2.4.5α-酮异戊酸节点代谢流分析

由图9e可知，α-酮异戊酸是主要副产物缬氨酸、亮氨酸的直接前体，削弱合成来源，可减少缬氨酸、亮氨酸的积累。优化组α-乙酰乳酸进入α-酮异戊酸的代谢流为3.7，比对照组减少了69.25%，进入合成Val的代谢流减弱了67.12%，合成亮氨酸的代谢流减弱了72.21%；主要副产物缬氨酸、亮氨酸在理想代谢流分布中为0，说明缬氨酸、亮氨酸在整个代谢过程中可以完全没有[27,31-32]。在L-异亮氨酸发酵工艺控制中，葡萄糖亚适量是关键因素，发酵中后期减少葡萄糖供应有利于L-异亮氨酸的生成，同时可抑制缬氨酸、亮氨酸的产生。

3 结 论

为同时达到菌体生长与产酸能力的最大发酵性能，需要满足生产潜能所必需的条件。谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸对环境条件的波动敏感，本实验所采用的葡萄糖亚适量流加工艺，可以动态调节发酵条件，实现菌体的“发酵转换”。在发酵初始葡萄糖为80 g/L，90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下，得到动态补糖速率为0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h），OD600nm达到146，比最大补糖速率发酵提高了13.22%。该工艺优化了代谢流通量，从发酵控制方面使副产物氨基酸的生成减少，达到代谢流迁移的目的，从而增大合成L-异亮氨酸的代谢流，使得L-异亮氨酸产量达到了44.32 g/L，糖酸转化率提升到19.63%，同时副产物缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸分别降低到4.02、2.58、1.85 g/L 。