赤霉素浸种对柴胡种子发芽及内源激素变化的影响

袁梦佳， 杨太新， 孙延超

(河北农业大学农学院/省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物生长调控实验室， 河北 保定 07001)

柴胡为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功效，用于感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等症[1]。

近年来，随着柴胡药材需求量的增加，人工栽培面积不断扩大，但柴胡种子存在发芽率低、发芽时间长等问题，导致柴胡生产中播种量较大且难以保证苗全苗匀，严重影响了柴胡产量的提高和质量的稳定。种子萌发是一个由多种激素共同调节的复杂过程[2]。脱落酸(ABA)具有诱导种子休眠，抑制种子萌发，抑制赤霉素(GA3)生物合成及其信号传导等作用，ABA含量的下降又是种子萌发和生长的先决条件[3-5]；GA3在种胚发育过程中的作用是促进种胚周围的物质软化和加速胚细胞的生长和分化，并诱导一些酶类的合成与表达，来加快贮存物质的分解和具有胚轴结构物质的合成[6-7]；生长素(IAA)对种子萌发的调控具有双面性，即适宜浓度IAA促进种子萌发，过高浓度对种子有抑制作用[8]。玉米素苷(ZR)是属于细胞分裂素一类的植物激素，在植物生长和发育过程中起着重要的调控作用[9-11]。关于GA3浸种影响柴胡种子发芽的研究已有报道，孙延超[12]用不同浓度GA3溶液对柴胡种子进行浸种处理，结果表明，种子的发芽势和发芽率均呈显著差异；周洁等[13]研究表明，浓度为100～250 mg·L-1的GA3处理31号柴胡种子，提高了种子的发芽率和发芽势，且能使萌发启动日提前。但有关GA3浸种后柴胡种子发芽过程中的内源激素变化未见报道。因此本研究以冀柴1号为试验材料，研究不同浓度GA3浸种对柴胡种子发芽的影响，测定分析种子发芽过程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量变化，为揭示柴胡种子萌发调控及提高柴胡种子发芽率提供理论依据和可行方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试冀柴1号柴胡种子来源于河北省邯郸市涉县柴胡种植基地。

1.2 仪器与试剂

BIC-250人工气候培养箱、BS-223 S电子分析天平、Agilent 1260型高效液相色谱仪、KQ-300 VDV型双频数控超声波清洗器、HG-9240 A电热恒温鼓风干燥箱、TDZ 4-WS低速台式离心机、NAI-DCY-24 F型氮吹仪、MDF-382 E超低温冰箱。

ABA、GA3、IAA、ZR的标准品均从Solarbio公司购进，甲醇(色谱醇)、娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

分别用浓度为0(ck)、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1和200 mg·L-1的GA3溶液浸泡柴胡种子12 h，进行种子发芽试验，测定各处理浸种的柴胡种子萌发启动时间、高峰期、发芽势及发芽率，分析种子发芽过程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量变化。

1.3.1发芽率的测定

取不同浸种处理的柴胡种子进行纸培发芽试验，每皿100粒，16 h黑暗8 h光照，发芽温度为20 ℃，每个处理重复3次。每天记录种子发芽数，计算其发芽势、发芽率等指标。

发芽势(%)=(规定时间内发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%。

1.3.2内源激素含量的测定

每个处理分别发芽50皿，每隔0、8、16、24、32 d观察记录发芽情况，并将柴胡种子鲜样置于液氮中速冻，然后放入-80 ℃超低温冰箱保存，用于内源激素检测。用高效液相色谱法测定种子发芽过程中ABA、GA3、IAA和ZR的含量。

1) 色谱条件：色谱柱AgilentTC-C 18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相A：甲醇，流动相B：pH=3冰乙酸，进行梯度洗脱(表1)；流速1.0 mL·min-1；进样量每次10 μL；检测波长为254 nm；柱温30 ℃。

表1 梯度洗脱程序

2) 对照品溶液的制备：精密称取IAA、GA3、ABA和ZR标准品各0.005 g，用甲醇溶解定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成50 mg·L-1的母液，过0.45 μm有机滤膜，即为混合对照品溶液。

3) 样品的制备：称取约1.000 g发芽中的柴胡种子至预冷研钵中,加入预冷的80%甲醇溶液8 mL(加抗氧化剂BTH)，用液氮研磨匀浆，4 ℃避光浸提16 h。浸提液4 ℃ 16 000 r·min-1离心10 min，转移上清液至10 mL离心管中，加入0.2 g·g-1试样的PVPP去除酚类等杂质，超声震荡40 min过滤，滤液过C 18固相萃取柱，将流出液氮吹至水相(1.5～2.0 mL)。水相用1 mol·L-1柠檬酸调节pH=3.0，加入3 mL乙酸乙酯萃取，超声震荡40 min，转移上部液体至新的离心管氮吹(吹干乙酸乙酯)，之后加2 mL甲醇复溶，过0.45 μm有机滤膜即进瓶样品，样品备用[14-15]。

4) 线性关系建立：将混合对照品溶液用0.45 μm有机滤膜过滤，分别精密吸取混合对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样，记录色谱图。横坐标为进样体积，纵坐标为峰面积，绘制标准曲线，并计算出回归方程：

ABA，Y1=4 810.9x+142(r2=0.999 9)；

GA3，Y2=82.651X+41.383(r2=0.999 3)；

IAA，Y3=787.55x+4.702(r2=0.999 8)；

ZR，Y4=89.121X+68.542(r2=0.999 4)。

1.3.3数据分析

采用Excel 2010软件进行数据处理，利用软件SPSS 23.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 GA3浸种对种子发芽的影响

由表2可见，不同浓度GA3溶液浸种处理，使柴胡种子的萌发启动时间提前1～3 d，萌发高峰期提前1～3 d，种子的发芽势和发芽率均显著提高。随着GA3浓度的增大，种子发芽率呈现先上升后降低的趋势，150 mg·L-1处理的种子发芽率最高(64.5%)，200 mg·L-1处理的发芽率降低(41.7%)；种子发芽势表现相同的变化趋势，150 mg·L-1处理的种子发芽势最高(30.1%)，200 mg·L-1处理的发芽势降低(17.4%)。

表2 不同浸种处理的柴胡种子发芽状况

2.2 种子发芽过程中内源激素含量的变化

2.2.1种子发芽过程中的ABA含量变化

不同浓度GA3浸种处理的柴胡种子，发芽过程中的ABA含量变化基本一致，均呈“下降-上升-下降”的变化趋势(表3)，且均显著降低了柴胡种子发芽过程中的ABA含量，其中以150 mg·L-1处理的作用最为明显。未萌发时，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1处理的种子ABA含量分别为160.33 ng·g-1、154.41 ng·g-1、154.36 ng·g-1、140.00 ng·g-1，比对照分别下降了6.93%、10.37%、10.40%、18.73%。第16天时，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1处理的ABA含量在种子发芽过程中均最低，分别为36.61 ng·g-1、34.98 ng·g-1、30.77 ng·g-1、38.56 ng·g-1，ABA含量降幅最大，比对照分别下降了30.92%、34.00%、41.94%、27.25%。

表3 不同浸种处理柴胡种子发芽过程中的ABA含量

2.2.2种子发芽过程中的GA3含量变化

由表4可知，0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1浸种处理的种子GA3含量变化基本一致，均随发芽时间呈“降-升-降-升”的变化，分别在发芽第8天和第24天出现2个低峰值，200 mg·L-1处理的种子GA3含量一直呈逐渐下降趋势，发芽第32天时最低。不同GA3浸种处理均显著增加了柴胡种子发芽过程中的GA3含量，未萌发和发芽第8天均以200 mg·L-1处理的最高，分别为16.50 ng·g-1、15.61 ng·g-1；发芽16 d后均以150 mg·L-1处理的最高，发芽16 d、24 d、32 d分别为14.71 ng·g-1、9.31 ng·g-1、9.87 ng·g-1，比对照分别增加了283.07%、233.69%、166.76%。

表4 不同浸种处理柴胡种子发芽过程中的GA3含量

2.2.3种子发芽过程中的IAA含量变化

由表5可见，对照的IAA含量变化呈“下降-上升”趋势，未萌发时最高，为56.01 ng·g-1，第24天降至28.27 ng·g-1，第32天回升至31.74 ng·g-1。50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1处理的IAA含量变化基本一致，均呈“降-升-降-升”趋势，分别在发芽第8天和第24天出现2个低峰值。不同GA3浸种处理均显著降低了柴胡种子发芽过程中的IAA含量，未萌发时50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1处理的IAA含量分别为48.56 ng·g-1、47.44 ng·g-1、33.88 ng·g-1、32.00 ng·g-1。第24天时，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1处理的IAA含量在种子发芽过程中均最低，分别为25.26 ng·g-1、25.32 ng·g-1、21.67 ng·g-1、18.01 ng·g-1，比对照分别下降了10.65%、10.44%、23.35%、36.29%。

表5 不同浸种处理柴胡种子发芽过程的IAA含量

2.2.4种子发芽过程中的ZR含量变化

不同浓度GA3浸种的柴胡种子发芽过程中ZR含量均呈“升-降-升”的变化(表6)。与对照相比，其他处理均显著增加了柴胡种子发芽过程中的ZR含量，其中以150 mg·L-1处理的作用最为明显。未萌发时，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1的ZR含量在种子发芽过程均最低，分别为4.99 ng·g-1、4.98 ng·g-1、5.62 ng·g-1、4.64 ng·g-1，第16天时均最高，分别为7.54 ng·g-1、7.59 ng·g-1、7.81 ng·g-1、7.79 ng·g-1，比对照分别增加了2.45%、3.13%、6.11%、5.84%。

表6 不同浸种处理柴胡种子发芽过程中的ZR含量

2.2.5种子发芽过程中的激素比值变化

柴胡种子在发芽过程中IAA+GA3+ZR/ABA比值见表7，不同浓度GA3浸种处理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均为“升-降-升”的变化。未萌发时，150 mg·L-1处理的激素比值为0.362，显著低于其他处理，发芽第8天之后，150 mg·L-1处理的激素比值均显著高于其他处理，其中第16天最高，为1.094，比对照增长了111.20%。50 mg·L-1处理的激素比值与100 mg·L-1处理的差异不显著。

表7 不同浸种处理柴胡种子发芽过程中的IAA+GA3+ZR/ABA比值

2.3 种子内源激素与种子发芽率的相关性分析

不同浸种处理的柴胡种子内源激素含量和发芽率的相关性分析结果(表8)表明，种子的ABA含量与发芽率呈极显著负相关，相关系数为-0.825。GA3含量、IAA+GA3+ZR/ABA比值与种子发芽率均呈现极显著正相关，相关系数分别为0.968、0.849。ZR含量与种子发芽率呈显著正相关，相关系数为0.443。IAA含量与种子发芽率的相关系数为0.423，两者未达到显著相关水平。

表8 柴胡种子发芽率与内源激素的相关系数

3 小结与讨论

GA3作为一种信号物质，在促进种子发芽过程中发挥着重要作用，主要有加速细胞分裂、促进成熟细胞伸长的作用[3-5]。本研究结果表明，不同浓度GA3溶液浸种处理均能显著提高柴胡种子的发芽势和发芽率，且均以150 mg·L-1处理的最高，发芽势和发芽率分别为30.1%、64.5%。

种子发芽与其内源激素的含量变化密切相关[6-7]，GA3具有拮抗ABA的作用，通过增强种胚的活力来促进种子萌发[8,11]。本研究发现，与对照相比，不同浓度GA3浸泡的种子发芽过程中ABA含量均显著降低，GA3含量均显著增加，表明GA3浸种在降低柴胡种子ABA含量的同时提高了GA3含量，从而使柴胡种子朝着有利于发芽的方向发展。此结果与王宁等[10]、宋发军等[11]的研究结论一致。另外，不同浓度GA3浸种处理的IAA含量均低于对照，且IAA含量与柴胡种子发芽率的相关系数为0.423，未达到显著水平，这与韩志龙等[16]用GA3处理驼绒藜种子的研究结论不相符，有待进一步探讨。种子ZR含量与ABA含量变化趋势相反，ABA含量下降时，ZR含量上升，此结果也与王宁等[3]的研究结论基本一致。

影响种子发芽和休眠的内源激素可能不是单独起作用的，而是受到激素间交互作用的影响，特别是促进与抑制生长激素之间的比例对种子发芽具有重要意义[3,17]，GA3可以通过影响种子内源激素含量及其比值变化从而促进种子发芽[18-20]。本研究结果表明，柴胡种子发芽过程中，不同浓度GA3浸种处理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均显著高于对照，且该比值与种子发芽率呈极显著正相关，相关系数为0.849。表明GA3处理可能通过调节IAA+GA3+ZR/ABA比值上升，进而促进柴胡种子发芽。