濒危植物曲茎石斛种子无菌萌发研究

刘 靖， 胡泽方， 程志杰， 王仕沁， 王玉兵

(三峡大学生物技术研究中心， 湖北 宜昌 443002)

曲茎石斛(Dendrobiumflexicaule)为兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，零星分布于河南、湖北、湖南、四川和重庆等地，多生于海拔1 200～2 000 m的悬崖石壁上[1]，曲茎石斛因具有极高的药用价值而作为西枫斗的原植物之一。曲茎石斛生境特殊，分布范围狭窄，加之药农的无节制采挖，其野生资源日趋枯竭，为国家一级保护植物[2]，被IUCN(世界自然保护联盟)定为濒危种[3]。目前曲茎石斛的研究主要集中于组织结构[4]、实名认证[5-7]、组织培养[8-10]和室外移栽[11]等方面，而其种子萌发的研究还属空白。曲茎石斛与其他兰科植物一样，种子不具胚乳，在自然条件下萌发困难，因此开展曲茎石斛的种子萌发研究对其保护与利用具有重要的意义。本研究以曲茎石斛种子为研究材料，研究其萌发过程和最佳无菌萌发条件，其结果可为曲茎石斛的保育和快速繁殖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

曲茎石斛蒴果于2018年11月采自湖北省神农架国家公园，为自然授粉的果实，果实饱满且无病虫害。

1.2 方 法

1.2.1种子活力检测

四唑测定法(Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC)测定种子活力，称取约2 mg曲茎石斛的种子于5%次氯酸钙中浸泡2 h，无菌水洗3次，蒸馏水浸泡24 h，去掉蒸馏水，置1%TTC溶液黑暗浸泡48 h，无菌水清洗3次，最后1次留1 mL水制成悬浮液。吸0.1 mL种子悬浮液于载玻片上，在显微镜下随机观察3个视野，记录每个视野的种子总数及胚染成红色的种子数，以胚染成红色计为有活力的种子，重复10次，计算种子活力[12]。

1.2.2外植体消毒

将曲茎石斛蒴果先用流水洗净，然后在超净工作台中用75%酒精浸泡120 s，并用0.1%的HgCl2灭菌16 min，最后用无菌水冲洗5次。

1.2.3不同培养基对曲茎石斛种子萌发的影响

将灭菌后蒴果用手术刀纵向切成两半，将种子接种在1/2 N6(N6、1/2 MS、MS)+100 g·L-1马铃薯泥(香蕉泥)+ 0.5 g·L-1活性炭+30 g·L-1蔗糖培养基上，每个处理接种10个皿，重复3次。培养21 d后用体式显微镜(Leica MA 125)统计萌发率，以种子出现原球茎计为萌发[13-15]，在体式显微镜下取不同视野统计50～100粒种子中的萌发率[9]。

2 结果与分析

2.1 种子活力检测

曲茎石斛种子经TTC染色后，发现其种子活力较高，但染色程度不一，其中绝大部分种子染色较深，表明种子活力较强(图1-a)；极个别种子未被染色(图1-b)；少数种子染色较浅，表明活力较弱(图1-c)。以种子成功染色计为具有活力，统计结果表明，曲茎石斛种子活力为93.52%。

注：a为染色较深的种子活力强；b为未染色种子无活力；c为染色较浅的种子活力弱。

2.2 种子萌发过程

成熟的曲茎石斛种子呈纺锤状，两端稍尖，中间较粗，有一个极细小的种胚，外部被一层透明状的种皮包被(图2-a)。其种子萌发大致会经过4个阶段，吸胀阶段为从播种至播种7 d时，种子开始慢慢吸水，种子在一定程度上由黄绿色转变为淡绿色(图2-b)。原球茎形成阶段是播种的14～35 d：播种14 d后，种子持续增大，种胚挤压种皮，致其破裂，露出部分种胚即为萌发(图2-c)；播种21 d后，种胚膨大由椭圆形变为圆形，突破种皮的种胚逐渐变绿，原球茎逐渐形成(图2-d)；28 d后，种皮渐渐消失，表现出一定的极性，即原球茎有明显的根底部(图2-e)；播种35 d后，原球茎的顶端细胞分裂出现凸起，且基部出现纤毛状假根(图2-f)。叶形成阶段是播种后的42～56 d：播种49 d后，成熟的原球茎两极性明显，原球茎顶端隆起部位不断伸长分化成幼叶(图2-g)。生根阶段是播种后的56～84 d：播种56 d后，基部开始长出幼根(图2-h)，随后基部根逐渐伸长，至84 d时，幼苗平均生长2条根，叶片延长展开形成幼苗，此时苗高1 cm左右，根长1～2 cm(图2-i)。

注：a为有胚的未发芽的种子；b为种胚吸水增大；c为种胚增大引起种皮破裂(萌发)；d为原球茎的形成；e为长有“纤毛”的原球茎；f为幼叶形成；g为叶片的形成；h为幼苗初步形成；i为幼苗；CI为纤毛；SA为茎尖；FL为第1片幼叶；YR为幼根。

2.3 不同培养基对种子萌发的影响

曲茎石斛种子在不同培养基中均能萌发，并表现出较高的萌发率(表1)。从萌发率来看，基本培养基为1/2 N6，外源添加物为马铃薯泥或香蕉泥时种子萌发率最高，分别为98.8%和97.7%，并且萌发速度最快，可在14 d内开始萌发；而未添加外源添加物的1/2 MS培养基中萌发率较低，但仍然在80%以上，表明外源添加物对曲茎石斛的萌发有明显的促进作用，并具有显著性差异；马铃薯泥和香蕉泥对曲茎石斛种子萌发影响的差异不显著。结果还表明，外源添加物对根的分化具有显著影响，马铃薯泥可促进根的形成，而香蕉泥对促进根形成的影响并不明显，当香蕉泥为外源添加物时，其成苗过程中几乎没有根的形成。

表1 不同培养基中曲茎石斛种子萌发情况

3 讨论与结论

种子活力指标作为反映种子萌发速度、幼苗发育潜力的重要因素[16-17]，是播种育苗前的必要检测指标，而TTC法作为测定种子活力最主要的方法，具有操作简单、耗时短，且不受种子休眠限制的优点，被列入ISTA和我国的种子检验规程[15,18]。本研究利用TTC法测定曲茎石斛种子活力为93.52%，而无菌萌发结果表明，其种子萌发率最高可达98.8%，表明TTC法对于曲茎石斛种子活力的检测具有一定的局限性，后期可在TTC浓度、次氯酸盐浓度及处理时间等方面进行条件优化，以探索最佳TTC法检测曲茎石斛种子活力的方法。石斛属植物的无菌培养多用人工授粉的种子，并有较高的萌发率[18-19]，但林爱英[20]将细茎石斛(D.moniliforme)的自然授粉、人工异花、人工异源3种授粉方式的种子活力进行了对比，发现自然授粉种子活性最强，其结果与本实验结果相似，自然授粉的种子也有较高的种子活力。

兰科植物种子无菌萌发可能与胚的体积有一定关系，不同兰科植物形态变化也不尽相同，如黄花白芨(Bletillaochracea)种子吸水胀大，种胚从种皮一侧突破形成偏长的原球茎，叶原基是在未完全突破种皮时形成的；独蒜兰(Pleionebulbocodioides)种子萌发则有两种方式，一种是种胚变绿突破种皮形成椭圆形原球茎，另外一种则为种胚吸水逐渐成为淡黄色的胚体，胚体胀大从种皮一端突破而萌发，刚突破种皮时形成叶原基[21]；流苏石斛[21](D.fimbriatum)、无距虾脊兰(Calanthetsoongiana)种子[22]则种胚吸水膨胀，从椭圆形逐步变为圆球状，然后从种皮的中央或一端突破形成球形原球茎，种皮褪去形成叶原基；春剑(Cymbidiumtortisepalumvar.longibracteatum)种子在无菌萌发时，种子吸水胀大形成原球茎，继而膨大形成根状茎，再逐步成苗[23]；而Dendrobiumaqueum的种子在萌发时，其种胚吸水胀大形成原球茎，顶端逐渐长出幼叶，随后原球茎继续膨大，形成完整植株[14,24]。同样，曲茎石斛种子萌发也是经历从吸胀突破种皮，逐步变成原球茎，然后形成叶芽、生根成为完整植株，与Dendrobiumaqueum的种子在萌发成苗过程基本一致。

兰科植物因种子细小，果实成熟时种胚未成熟，被透明状种皮包裹的种胚，无胚乳，故在自然条件下萌发率极低，但可通过利用培养基进行非共生培养以促进种子快速萌发[25]。现有研究表明，不同兰科植物的非共生萌发所需基本培养基不尽相同，常用的基本培养基为MS、N6、B5等[26-27]。如铁皮石斛(D.officinale)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、齿瓣石斛(D.devonianum)等种子在N6基本培养中表现较高的萌发率[26]；而花叶开唇兰(Anoectochilusroxburghii)种子在1/4 MS培养基上萌发最快，萌发率也最高，且萌发得到的原球茎最健壮[28]。高立献等[29]对曲茎石斛的无菌播种进行了初步研究，其结果以MS为最佳培养基，而本实验通过多次摸索发现1/2 N6为曲茎石斛种子萌发的最佳基本培养基，与N6、1/2 MS及MS作为萌发基质曲茎石斛萌发率之间存在显著性差异，萌发率可达98.8%。

外源添加物也是影响石斛种子无菌萌发一个重要因素，许多研究表明，香蕉或马铃薯汁均对金钗石斛(D.nobile)和铁皮石斛种子无菌萌发具有促进作用，且马铃薯因含有重要的维生素(B1和B6)和矿物质元素(如钾、铁、镁，以及碳水化合物和氨基酸)对种子萌发促进效果更佳[30-31]，本研究也得到相似的结果。Miransari和Smith[34]认为，种子在发芽过程中消耗大量的氮，故添加有马铃薯的培养基中发芽率会更高。本实验在基本培养基1/2 MS和1/2 N6中添加马铃薯泥之后，种子萌发时间不仅缩短，且萌发形成的原球茎既大又壮，有利于幼苗的形成以及根的生成，表明马铃薯泥不仅可促进曲茎石斛种子萌发，而且对分化也有促进作用。但白芨种子萌发过程诱导培养基中添加马铃薯泥之后，萌发率反而降低[26]。说明兰科植物萌发需要的条件不尽相同，即兰科不同种有不同的生物学特性。也有研究表明外源激素对兰科植物种子的无菌萌发有促进作用[31,35-36]，但本研究表明，在不添加外源激素的情况下，曲茎石斛种子萌发率依然很高，并且不添加外源激素，不仅可简化操作步骤，还可节约成本。

该实验摸索了曲茎石斛种子萌发过程及萌发最佳培养基质，曲茎石斛种子在最佳萌发培养基中，萌发率不仅高，而且原球茎又大又壮，可为后期曲茎石斛扩繁提供一定的实验基础。