多种中药协同对胆管癌细胞QBC-939增殖的影响

任元静，强家旭，陈 卉，宋 巍

(1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025； 2.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036)

胆管癌属于一种消化道的恶性肿瘤疾病，包括肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)。由于其特殊的位置易于侵犯肝门部的肝组织、血管、神经及淋巴组织，以至于根治性手术难度相当大，手术切除率低，愈后较差。不幸的是，胆管癌的总体发病率在世界范围内呈上升趋势，这严重威胁人类健康[1-2]。相关研究报道，大多数胆管癌患者是在癌症晚期诊断出的，接受切除和移植并不能改善治疗效果，但仍是获得长期生存率和治愈的唯一可能性手段[3]。对于晚期无法手术的患者可以通过药物辅助性治疗来达到手术治疗的最低要求。针对一条通路或单一靶点的药物在治疗初期疗效常常很好，但随后往往由于肿瘤细胞通过其他的通路逃避药物治疗，而导致疗效显著下降。多靶点药物和组合治疗策略目前已经成为生物医学领域研究的热门领域[4]。多数化疗药物对于晚期癌症患者的治疗所获得的生存率不佳，而且化疗常常使人体产生耐药性和副作用，故寻找出高敏感、低毒副作用的胆管癌治疗药物是十分必要的。本文通过对多种传统中草药进行筛选以及对其联合作用进行评价，从而为抗胆管癌的联合用药方案和治疗提供新的思路。

1 方法

1.1 药物与试剂

RPMI-1640、胎牛血清购自Gibco公司；MTT购自生工生物工程股份有限公司；胰酶和青-链霉素溶液购自吉诺生物医药技术有限公司；大血屯、升麻、苏木、枟香、黄连、土槿皮、连翘、黄柏等多种药用植物根茎叶购自张仲景大药房。

1.2 中草药提取

利用分体式全自动微电脑陶瓷壶将200 g中药和2 L纯净水混合液熬至150 mL的药液。接着将药液用冷冻干燥机干燥脱水研碎。

1.3 细胞培养和药物处理

人胆管癌细胞QBC-939为本实验室保存。QBC-939接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基中，随后放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将提取粉末溶于超纯水配制成100 mg/mL母液，过滤除菌后于-20 ℃保存备用。

1.4 细胞增殖检测

将QBC-939细胞以104个/孔接种于96孔板；待细胞达到对数生长期时，使用含有不同浓度的药物培养液代替初始培养液继续放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h；接着向每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h；最后，弃去上述培养液加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)混匀后于490 nm处检测吸光值(OD值)。两两联合药物培养液浓度比例为11(联合药物终浓度为25、50、100、200、300、400 μg/mL)。每个药物试验至少重复三次。

1.5 中值效应分析

通过以相应药物的IC50为基础，增加联合使用的药物总剂量，通过MTT试验测定细胞的存活率。根据Chou-Talalay中效原理，由Compusyn软件计算药物联合指数CI(combination index)[5-6]以及剂量减少指数DRI(drug reduction index)。DRI是衡量相同的药物作用水平下，协同使用相比单独使用每种药物时，剂量减少倍数的指数。DRI值越大意味着相同治疗效果下，联合相比于单味药减少的越多，但不一定是协同作用。

2 结果

2.1 多种单药对QBC-939细胞的抑制作用

联合指数计算须基于联合药物各浓度的抑制率，故通过设置较长浓度区间，初步确定8种单药在不同浓度下的抑制效果并由此确定各种单药的IC50值。分别使用不同浓度(5、25、50、100、200、400 μg/mL)的单药处理胆管癌QBC-939细胞24 h，之后检测细胞存活率，得到各种中药分别对胆管癌细胞QBC-939的半数抑制浓度IC50值，如图1所示。其中，苏木(IC50= 91.63±23.27 μg/mL)、升麻(IC50= 91.5±31.76 μg/mL)、大血屯(IC50= 61.73±58.70 μg/mL)对胆管癌细胞增殖的抑制作用较好，即较低的IC50值。其他单中药IC50值如表1所示。

图1 8种中药的IC50值

表1 8种中药对QBC-939细胞的抑制作用

2.2 联合中药的协同作用

由8种中药两两组合，共28种组合。通过MTT法从28种组合中筛选出对胆管癌细胞QBC-939有显著抑制作用的6种组合：黄连-苏木、黄连-黄柏、苏木-黄柏、连翘-升麻、枟香-连翘和枟香-升麻。6种中药组合的浓度-抑制率成梯度关系(见图2(a)、图2(b))。其中黄连-苏木、黄连-黄柏、苏木-黄柏、连翘-升麻、枟香-连翘5种组合呈协同作用，枟香-升麻呈拮抗作用，如图3、图4、图5和表2所示。同时，通过比较每种中药组合在相同抑制率水平时，联合使用两种药物的浓度与该两种药物单独使用的浓度，可得到药物的浓度减少倍数，即DRI剂量减少指数，见表3。

(a) (b)

由表2、表3和图3可知：黄连-黄柏组合在25%抑制率时，联合黄柏使用的黄连浓度相比单独使用的黄连浓度减少2.258 3倍，即DRI=3.029 3；同时，联合使用的黄柏浓度减少3.029 3倍，并且黄柏浓度随着抑制率增加而显著减少；当抑制率达到90%时，黄柏浓度减少1 154.08倍。由于联合用药浓度相比单独用药浓度显著减少，所以黄连-黄柏组合表现强协同作用(CI<0.5)。当苏木-黄柏组合在高抑制率区间时，联合使用的苏木与黄柏的浓度相比较两种药物单独使用的浓度显著减少，在75%～90%抑制率区间时，苏木浓度减少2.301 9～3.819倍；黄柏浓度减少457.023～4 935.35倍，因此黄连-苏木组合表现强协同作用(CI<0.5)。

图3 黄连-黄柏、苏木-黄柏药物组合的联合曲线

由表2、表3和图4可以发现：当黄连-苏木组合在高抑制率区间，联合使用的黄连与苏木的浓度相比较药物单独使用的浓度显著减少，当75%～90%抑制率时，黄连浓度减少7.845 6～10.013 8倍；苏木浓度减少2.824 1～4.042 1倍，因此黄连-苏木组合表现强协同作用(CI<0.5)。同时，枟香-连翘组合仅在0%～25%低抑制率区间，表现出强协同作用(CI<0.5)，联合使用的枟香与连翘的浓度相比较单独使用的浓度减少。但在75%～90%高浓度区间，枟香-连翘组合表现拮抗作用(CI>1)。

图4 枟香-连翘、黄连-苏木药物组合的联合曲线

由表2、表3和图5可知：枟香-升麻组合在不同抑制率时，联合使用的枟香与升麻的浓度相比较单独使用的浓度都没有显著降低。因此，枟香与升麻呈拮抗作用(CI>1)。另一方面，连翘-升麻组合仅在75%～90%高抑制率区间表现出协同作用(CI<1)，联合使用的连翘与升麻浓度相比较单独使用的浓度分别减少5.622～5.062 9倍和1.324 5～3.068 6倍。

图5 枟香-升麻、连翘-升麻药物组合的联合曲线

表2 药物组合在不同抑制率中的联合指数CI

表3 药物组合在不同组合中的剂量减少指数DRI

3 讨论

传统中草药以天然药物治疗疾病在我国有着悠久的历史，其活性更多地依赖于多种成分的组合，而不仅仅是其中单一的某种成分。许多中草药可以通过靶向肿瘤发生过程中的多个步骤，能够抑制肿瘤的发展，它既具有阻滞剂，抑制肿瘤起始发生的作用，又具有抑制肿瘤发展过程中恶性细胞增殖的作用[7-9]。中药联合化疗药物还可以降低化疗药物带来的副作用，提高治疗效果[10-12]。滕文静等，在温阳散寒中药抗肺癌的研究中，基于温阳扶正抗癌的理论，通过收集文献报道以温阳法治疗恶性肿瘤最有效的五味中药进行体内Lewis小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用实验，发现中药中的生物碱类成分荜茇明碱具有明显地抑瘤作用[13]。因此，通过实验研究试图从中国传统的中草药中寻找具有抗肿瘤的药物。通过体外实验比较人胆管癌QBC-939细胞对31种中草药的敏感性，从中筛选得到大血屯、升麻、苏木、枟香、黄连、土槿皮、连翘、黄柏8种具有抑制胆管癌细胞增殖效果的药物。

中药复方在抗肿瘤方面的研究是近年来的热点，单一药物成分有时容易使肿瘤细胞产生耐药性、抵抗性，从而表现出较低的抑制效果。左金丸是一个典型的中药复方，由黄连和吴茱萸以61比例组成。黄连中的主要成分有逆转MDR的效果，吴茱萸可以诱导肿瘤细胞凋亡。左金丸在体内外实验中均可逆转多药耐药性结直肠癌。左金丸可以增加结肠癌 HCT116/L-OHP细胞、胃癌SGC7901/DDP细胞和肝癌 Bel/Fu MDR细胞对化疗药物的敏感性[14]。表明中药与化疗药物的联合使用在抗肿瘤增殖方面具有潜能。本研究通过检测由8种中药组成的28种中药组合对胆管癌细胞QBC-939的增殖抑制作用发现：黄连-苏木，黄连-黄柏，苏木-黄柏，枟香-连翘和连翘-升麻5种药物组合在抑制胆管癌增殖过程中具有协同效应。表明联合中药相对于单药使用具有更好的抗肿瘤增殖效果，中药组合具有体外抗胆管癌细胞QBC-939的作用，能够为胆管癌的临床治疗提供一定理论基础。