香菇多糖提取纯化、生物活性及构效关系研究进展

陈 静,李巧珍,宋春艳,章炉军,尚晓冬,辜运富2

(1国家食用菌工程技术研究中心,农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室,上海市农业科学院食用菌研究所,上海 201403;2四川农业大学资源学院,成都 611130)

香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler俗称香蕈、花菇,属担子菌门伞菌纲伞菌目光茸菌科。香菇因其鲜美口味和营养价值,成为最受欢迎的食用菌之一,主要种植于中国、日本及其他亚洲国家[1]。烘干后的香菇含58%—60%碳水化合物、20%—23%蛋白质、9%—10%纤维、4%—5%灰分和3%—4%脂肪[2]。国内外学者从香菇菌丝体和子实体中分离出多种活性成分,包括多糖[3-4],蛋白质[5-6],嘌呤[7-8]等。其中,香菇多糖因其丰富的营养和药用价值受到了广泛的关注和研究[9]。香菇多糖以β-(1→3)葡萄糖残基为主链,β-(1→6)葡萄糖残基为侧链,单糖组成主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖[10,3]。研究表明,香菇多糖具有免疫调节[11-12]、抗氧化[13-14]、抗肿瘤[15-16]、抗病毒[17,3]等活性。本研究通过对香菇多糖提取纯化、生物活性及构效关系几个方面的研究进行综述,以期为香菇多糖的后续研究与开发利用提供理论依据。

1 香菇多糖的提取纯化

香菇多糖一般采取传统方法,以水为溶剂,加热提取。多糖提取率受料液比、时间、次数和温度等因素的影响。冯贤达等[18]研究表明,多糖提取最佳工艺为料液比1∶30,提取温度90℃,两级错流提取。第1级提取60 min,第2级30 min。李博等[19]研究表明,香菇多糖热水浸提最佳工艺为:浸提时间90 min,温度80℃,料液比1∶45,醇析乙醇量1∶3,此条件下多糖得率为24.88%。万阅等[20]研究表明,与传统热水浸提法比较,超声波提取法多糖得率更高,且耗时少。Zhao等[4]采用超声辅助多糖提取,最佳提取条件为:温度45℃,时间21 min,超声功率290 W,多糖得率可达9.75%,是热水萃取的1.62倍。聂小宝等[21]发现,与传统提取方法相比,微波辅助提取具有时间短、多糖纯度高、节能、操作简单、安全、提取率高等优点。程俊文等[22]结果表明,纤维素酶﹑果胶酶﹑木瓜蛋白酶的最佳提取工艺参数依次为加酶量0.8%,温度45℃,pH 4.5,提取时间1 h;加酶量1.0%,温度45℃,pH 3.5,提取时间2.0 h;加酶1.0%,温度45℃,pH 4.0,提取时间1.5 h。Ke等[23]研究表明,匀浆法能够有效地提高香菇多糖的提取效率。Li等[14]用真空技术破壁提取香菇多糖,并采用响应面法优化提取工艺参数。结果表明,多糖提取的最佳条件是62℃,真空0.08 MPa,1 200 r∕min搅拌25 min,料液比1∶26(V∕W)。在此条件下,多糖的得率为4.28%。Zhang等[24]采用超声强化亚临界水两步法从香菇中提取多糖,最佳工艺条件:萃取温度140℃,提取时间40 min,料液比1∶25(V∕W),超声波功率190 W,该条件下多糖的提取率为17.34%。

香菇多糖基本提取溶剂有三种:酸溶液、碱溶液和水。提取的粗多糖可通过一系列技术进一步纯化,如用乙醇、乙酸、CTMAB等沉淀,过氧化氢脱色,Sevag法去除蛋白质,离子交换色谱法、凝胶过滤法和亲和色谱法层析[25]。通常,离子交换色谱法用来分离中性多糖和酸性多糖[26]。香菇多糖的几种提取方法和纯化工艺见表1。

表1 香菇多糖不同提取方法和纯化工艺Table 1 Identification of lentinan by different extraction method and purification procedure

2 香菇多糖的生物活性

2.1 免疫调节活性

食用菌多糖能增强人体免疫力,帮助宿主适应不同的环境胁迫且无副作用,被称为生物反应调节剂(Biological response modifiers,BRMs)[25,34]。香菇多糖可刺激宿主产生不同的效应细胞并发挥作用,如T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞,也可增加免疫细胞的吞噬能力来杀灭人体中的癌细胞,且对迁移的癌细胞也有作用。它被称为体内T细胞定向免疫增强剂、巨噬细胞抗肿瘤活性的刺激剂[35-37]。Kupfahl等[11]检测了香菇多糖在小鼠李斯特菌感染模型中的免疫应答作用,发现香菇多糖可通过增强CD8 T细胞的特异性来提高小鼠抗李斯特菌的作用。同时,香菇多糖能促进B淋巴细胞增殖,诱导B淋巴细胞分化并合成抗体[38-40]。另外,Wang等[41]结果表明,无论体外还是体内,香菇多糖可以通过增强体腔细胞的生存能力和吞噬作用提高日本海参的非特异性免疫力。

2.2 抗肿瘤活性

1969年,Chihara从香菇中分离出香菇多糖,发现其可使测试小鼠肿瘤缩小80%或完全消退[42-43]。香菇多糖抗肿瘤作用的重要机制为在肿瘤部位触发延迟型超敏反应,并诱导免疫细胞的产生,如自然杀伤细胞和T细胞[44]。且香菇多糖能增强某些特定免疫细胞的吞噬能力,以搜索和破坏人体迁移癌细胞[45-46]。另外,香菇多糖能在体外抑制小鼠肉瘤细胞的增殖,其抑制率与分子量有关[32]。Zhang等[27]研究发现,香菇多糖可通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡,且对荷瘤小鼠体重和器官没有不良影响。Zhang等[47]研究表明,香菇多糖诱导肿瘤细胞凋亡是通过快速刺激活性氧的产生,使线粒体膜电位丧失以及细胞内Ca2+浓度增加形成的。

2.3 抗氧化活性

抗氧化活性是天然多糖的一种常见生物活性,受原料、提取工艺和干燥方法影响[48-50]。Wang等[13]研究表明,香菇菌丝体多糖具有抗氧化活性,可降低衰老风险。不同提取方法获得的多糖不仅具有不同的化学成分和构象,而且抗氧化活性也不同。Chen等[51]用热水从香菇子实体中提取粗多糖LEP(Lentinus edodespolysaccharide),经DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B层析纯化得到三种多糖组分,其中,LEPC1具有明显的浓度依赖性抗氧化活性。Zhang等[24]采用超声强化亚临界水萃取法(Ultrasonic enhanced subcritical water extraction,USWE)从香菇中提取多糖,通过DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)自由基清除法评价其抗氧化活性,并与亚临界水萃取(Subcritical water extraction,SWE)、超声波萃取(Ultrasonic extraction,UE)、热水萃取(Hot water extraction,HWE)多糖样品进行比较,发现USWE样品的抗氧化活性最高。与传统热水萃取法相比,动态超高压微射流技术(Dynamic high pressure microfluidization,DHPM)辅助萃取香菇多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和亚硝酸盐的清除能力更强。香菇多糖的抗氧化能力还与其分子量有关,低分子量组分具有较高的抗氧化能力,而高分子量组分具有较强的抗肿瘤活性[33,52-53]。

2.4 抗病毒活性

一般来说,抗病毒化合物抑制甚至杀死病毒主要通过三种方式:第一,直接接触并杀死病毒;第二,防止病毒吸附渗透到宿主细胞;第三,阻碍病毒复制和生物合成或抑制病毒组装、成熟和释放[54]。香菇多糖在体外对传染性造血器官坏死病病毒表现出一定程度的直接灭活作用[55],其机制可能与稳定的病毒-多糖复合物占据病毒包膜上的位点有关[56-59]。香菇多糖具有抗人体免疫缺陷病毒和单纯疱疹1型病毒作用[60-61],且具有较强的体外抗乙型肝炎病毒活性[4]。香菇多糖能抑制1型脊髓灰质炎病毒和1型牛疱疹病毒的复制[17]。此外,香菇多糖可以选择性地与细胞表面受体结合,进一步抑制病毒在细胞中的侵袭[55,62]。Ren等[3]从香菇菌丝体中提取了一种具有抗病毒活性的多糖,其通过调节机体的先天免疫和特异性免疫来实现直接灭活病毒和抑制病毒复制。

3 香菇多糖的构效关系

香菇多糖的初级结构以(1→3)-β-D-葡萄糖残基为主链,每5个葡萄糖有2个(1→6)葡萄糖残基支链,支链由(1→6)-β-D-和(1→3)-β-D-葡萄糖残基组成,也含有少数内部β-(1→6)键[63]。Maeda等[64]利用光散射测定的香菇多糖的平均分子量为950—1 050 ku,Suzuki等[65]通过凝胶渗透色谱和准弹性光散射测定的香菇多糖的分子量为300—800 ku[65]。Zhang等[66]采用超声辐照法获得了304—1 832 ku不同分子量的香菇多糖。

3.1 结构与生物活性的关系

多糖由一定数量的单糖残基组成。多糖的一级结构是通过单糖残基位置、糖链的位置以及单糖残基的序列来确定的[38]。对食用菌来说,主链由β-(1→3)连接且有β-(1→6)分支的葡聚糖结构,具有抗肿瘤活性,主链由(1→6)连接的β葡聚糖活性较低,高分子量葡聚糖比低分子量葡聚糖活性高[67-69]。当香菇多糖经二甲基亚砜、尿素或氢氧化钠处理后,其三级结构被破坏,随着变性程度的加深,抗肿瘤活性降低[70]。另外,研究发现,主链的分支度也是影响其活性的因素。一般来说,活性最强的聚合物的分支度在20%—33%[38]。Bae等[71]研究发现,多糖去分支可以提高其生物活性,当香菇多糖的分支度为32%时,免疫调节和抗肿瘤活性最大。

药用食用菌免疫刺激活性不仅来源于生物活性多糖,还可通过多糖-蛋白复合物产生。螺旋葡聚糖可附着在某些蛋白上形成复合物,进而刺激巨噬细胞产生抗体[72]。研究表明,当β葡聚糖与蛋白质以复合物形态存在时,其生物效率得到提升[73]。香菇多糖-蛋白质复合物在体内比未结合蛋白的多糖具有更高的抗肿瘤活性,且进一步分离蛋白后的香菇多糖无抗肿瘤活性[74-76]。这表明多糖结构的复杂程度与其免疫调节和抗肿瘤活性的强弱有关。

3.2 分子量与生物活性的关系

多糖是天然高分子多聚物,分子量的高低是影响其生物活性的重要因素。分子量过低,多糖不能形成具有活性的聚合结构,而过高则不利于多糖进入生物体内[77]。众所周知,香菇多糖的分子量与免疫增强活性密切相关[28,78]。相对分子质量高的香菇多糖比相对分子质量低的具有更强的抗病毒活性[4]。这可能与其和免疫细胞碳水化合物受体的亲和力不同有关[79]。分子量为400—600 ku的香菇多糖具有多种生物活性,如抗肿瘤(纤维肉瘤)、抗病毒(新城疫病毒)、刺激细胞因子表达等[26,1]。Ren等[3]研究发现,合适分子量的多糖能够保证自身轻易通过组织屏障进入细胞,极大地提高了其抑制病毒复制的生物学效率。Qian等[33]研究发现,分子量最高的香菇多糖的抗肿瘤活性较差,可能是因为香菇多糖的体积太大,无法进入细胞所致。而分子量较高的香菇多糖对体外培养的人原位胰腺腺癌细胞和人宫颈癌细胞均有较高的抑制作用。Wang等[29]研究也发现,高分子量多糖的抗肿瘤作用强于低分子量多糖。高分子量多糖在各浓度水平上具有较高的肿瘤抑制率,而且表现良好。

4 总结与展望

香菇多糖是一类结构多样的大分子聚合物,其单糖组分通过糖苷键相互连接,不同的连接位点,会形成多种多样的分支结构或线性结构。随着香菇全基因组测序的完成,学者们已经开始从分子水平上揭示香菇多糖代谢调控机制,但其多糖合成的代谢途径还难以解析。目前,香菇多糖主要靠从香菇子实体或菌丝体中分离纯化,提取分离步骤复杂、得率低、质量难以控制,无法满足工业化生产的需要。为提高香菇多糖得率,不仅可以采用新型技术辅助提取香菇多糖,而且可以通过遗传育种手段提高香菇菌种多糖含量,包括紫外诱变[80-81]、氮离子诱变[82]、紫外诱变结合杂交育种[83]等。如何将新技术与遗传育种研究成果更好地应用于实际生产中,需要结合实际情况做更多的研究和转化工作。

香菇多糖具有多种药效,包括免疫刺激[12]、抗肿瘤[16]、抗感染[84]和抗炎[85]等。但是,要提高其水溶性、口服后渗透肠道黏膜的能力及临床疗效,还需要与化学修饰、纳米生物技术、靶向治疗和免疫治疗等新兴技术相结合,开展相关的临床试验。另外,虽然香菇多糖具有多种生理活性,但是其结构复杂,均一多糖获取困难,而且不同材料不同提取方法获得的多糖在结构和活性上存在差异,缺乏对其构效关系的完整认识。而要阐明多糖的构效关系,则要通过生物、化学、计算机等手段,将各种仪器方法确定的基本结构参数和活性参数集合起来。