草莓菠萝复合酵素成分及其体外生物活性研究

段晓宇，曾 莉，樊 睿，赵治巧，万玉军，陈 惠，王 刚，唐自钟*

1四川农业大学生命科学学院，雅安 625014；2四川省食品发酵工业研究设计院，成都 611130

草莓(FragariaxananassaDuch.)为蔷薇科蔷薇亚科草莓属宿根性多年生常绿草本植物，其果肉富含维生素和微量元素，具有很高的营养经济价值，栽培面积和产量仅次于葡萄。菠萝又称凤梨(Ananascomosus(L.) Merr.)，属于凤梨科凤梨属植物，其主要生长在南美洲等热带地区，属于世界第三大热带水果之一。但他们含水量较高，不宜保存，从而通过一定技术延长其货架期显得极为重要。

酵素最初起源于日本，现今日日本酵素一年可达到1 000亿日元以上的市场量[1]。酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等为原材料，与多种益生菌混合培养，最终发酵而成一种具有特定药理功能的液体或固体，因其发酵产物具有较好的抗氧化能力、大分子物质分解能力、抗衰老作用，而受到众多研究者的关注[2]。而水果酵素因其较好的生物活性逐渐成为热点，在果蔬发酵中微生物的选择尤为重要，如酵母菌(yeast)它能够提高食品营养价值，而且在生长过程中能够产生一些保健调理的物质，因此深受食品生产者的喜爱。而乳酸菌在发酵过程中能够产生大量的有机酸和醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制杂菌生长、促进消化吸收、防癌等生理功效[3,4]。水果果汁的浓度对发酵过程中产生酸性物质也有重要影响，有研究表明，当果汁加入量由30%增加到50%时，其发酵产酸性物质效率明显增强。酸度过高会对味觉和口腔产生较大刺激，而酸度过低则会影响酵素给人带来的愉悦感，酸度作为衡量酵素发酵的一个重要指标，将酸度控制在一定的范围内，能有效提高酵素的风味。使用多种益生菌混合发酵可以进一步改善酵素的口感风味，考虑用乳酸菌与酵母菌共同对进行发酵，酵母菌发酵可以产生醇，醇与酸反应会转化为酯，从而改变饮品的风味，提高饮品给人带来的舒适感。所以本研究采用保加利亚乳杆菌和果酒酵母复合菌种来发酵草莓菠萝，以获得对人体具有更高营养价值的水果酵素。

近年来，酵素制品已成为国际市场的主流，目前我国酵素制品主要在河南一带发展较好，但我国的酵素制品主要以单种蔬菜或者水果发酵占据主导。草莓和菠萝单独发酵获得的酵素产品已出现[5,6]，但对其复合酵素笔者尚未见到。并且由于水果具有含较多柠檬酸和易上火等特点，所以笔者建议，比起单一使用某种水果，将不同种类的水果混合搭配。合理的搭配，可以更加全面的改善身体状况。所以开发新型独特的菠萝草莓复合酵素制品具有良好的市场前景。因此，本研究以草莓菠萝混合果汁为原料，同时添加酵母菌和保加利亚乳杆菌发酵制备酵素，并对其发酵前后的化学成分含量、功效酶活力、抗氧化活性和抑菌能力进行初步研究，旨在提高草莓和菠萝的附加值并生产一种具有更高营养价值的复合酵素产品。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜草莓和菠萝市售；果酒酵母、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)(四川省食品发酵工业研究设计院)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大肠杆菌(Bacilluscoli)(四川农业大学生命科学学院发酵工程实验室)。

1.2 试剂与培养基

1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)(上海源叶生物有限公司)；水杨酸(成都科龙化工试剂有限公司)；邻苯三酚(四川西陇化工有限公司)；酚酶试剂盒和总超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研所)。其他试剂均为国产分析纯。

LB培养基(液体)：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，水100 mL，121 ℃灭菌30 min；固体培养基在每100 mL液体培养基中加1.7 g琼脂粉。

1.3 仪器与设备

DK-8D电热恒温水槽(上海三发科学仪器有限公司)；XZ18K-T高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；Multiskan Sky酶标仪(上海合商科学仪器有限公司)；HZQ-F160振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。其他均为实验室常规仪器。

1.4 方法

1.4.1 酵素制作工艺

挑选新鲜无坏的草莓和菠萝。在无菌条件下取其果肉，对果肉进行切块处理，将处理好的果肉装入已灭菌的榨汁机中榨汁，将榨汁完成的果肉按照1∶1的比例的装入无菌发酵瓶中，再往发酵瓶中依次加入无菌水、白砂糖、酵母菌、保加利亚乳杆菌，密封复合发酵6个月后获得草莓菠萝复合酵素。

1.4.2 草莓菠萝复合酵素化学成分研究

1.4.2.1 草莓菠萝复合酵素总糖研究

参考文献[7]，吸取2 mL不同浓度梯度(0～0.7 mg/mL)葡萄糖标准溶液，分别置入8只已标号的25 mL比色管中，加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，混合均匀后于100 ℃水浴锅中水浴加热5 min，取出，冷却至室温，用水稀释至25 mL，采用酶标仪于520 nm处测定吸光度，0号管为空白。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线为y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5。

取0.5 mL酵素液，加入2 mL 6 mol/L的盐酸溶液，沸水浴15 min，冷却后加入1.8 mL 6 mol/L氢氧化钠溶液，取2 mL液体于25 mL容量瓶中，后续步骤同标曲测定一样。按照标准曲线线性方程y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5计算出总糖含量。

1.4.2.2 草莓菠萝复合酵素总酚研究

参考文献[7]，取8支已标号的20 mL比色管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的没食子酸标准液，用蒸馏水稀释至比色管10 mL刻度线，每管加1 mL Folin试剂及2 mL 20% NaCO3，于100 ℃水浴锅中水浴加热1 min，冷却并用水稀释至20 mL刻度线，室温放置30 min，采用酶标仪在波长为650 nm时，测定吸光度A为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线为y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5。

取0.5 mL酵素液，后续步骤同标曲测定一样。总酚含量以没食子酸计，按标准曲线方程y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5计算总酚含量。

1.4.2.3 草莓菠萝复合酵素总黄酮研究

参考文献[8]，吸取0.2 mg/mL芦丁标准液0～0.50 mL于6 支干净试管中，分别加入2.5 mL 70%乙醇，0.15 mL 5%的NaNO2溶液，混合均匀在室温下静置6 min；随后加入0.3 mL 10%的AlCl3溶液摇匀静置5 min；再加入1.00 mL的1 mol/L的NaOH溶液；最后补水至总体积为5.00 mL，振荡均匀；于370 nm测定各管的吸光值。以吸光度(A)作为纵坐标，芦丁浓度作为横坐标，绘制标准曲线y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2。

准确吸取0.5 mL酵素液；后续步骤同标曲测定一样。按标准曲线方程y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2计算总黄酮含量。

1.4.2.4 蛋白质的测定

参照Chen等方法[9]测定草莓菠萝复合酵素发酵液中蛋白质含量。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制线性方程y=0.005 5x+0.064，R2=0.999 4。

1.4.3 功效酶活力的测定

1.4.3.1 淀粉酶和T-SOD活力测定

淀粉酶和T-SOD分别严格参照碘-淀粉比色法的试剂盒和总超氧化物歧化酶活力测定试剂盒的操作步骤进行。

1.4.3.2 蛋白酶活力测定

借鉴酪蛋白消化法测定酶活性[10]，使用公式(1)计算蛋白酶活力值。

蛋白酶活力(U/mL)=AK×4/10×N

(1)

式中：A为实验组酵素液的吸光度；K为吸光度等于1时酪氨酸的量；4为反应溶液的总体积，mL；10为反应时间，min；N酶液稀释总倍数。

1.4.3.3 脂肪酶活力测定

参考Dong等[11]的方法测定脂肪酶活力，使用公式(2)计算脂肪酶活力值。

X=(B-A)×C/0.05×50×1/15×n=

200/3×(B-A)×C×n

(2)

式中：X为样品的酶活力，U/mL；B为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；A为滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；C为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；0.05为氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；50为0.05 mol/L氢氧化钠溶液1.00 mL相当于脂肪酸50 μmol；1/15为反应时间15 min，以1 min计；n为稀释倍数。

1.4.4 草莓菠萝复合酵素抗氧化活性测定

1.4.4.1 对DPPH自由基清除能力的测定

在酶标板上，按样品稀释倍数梯度，分别加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液100 μL和梯度样品溶液100 μL混匀，室温避光静置30 min后，于λ=517 nm处测OD值，以无水乙醇作调零。每组做三个平行组，使用公式(3)计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(3)

式中：A1为对照组吸光度；A2为样品组吸光度。

1.4.4.2 对OH自由基清除能力的测定

参照Yao等[12]的方法测定酵素对OH自由基清除能力，使用公式(4)计算OH自由基清除率。

OH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(4)

式中：A1为样品组吸光度；A2为本底吸光度；A0为空白对照吸光度。

1.4.4.3 对ABTS自由基清除能力的测定

实验前用无水乙醇稀释ABTS储备液至吸光度A为7±0.02。取10 mL EP管编号，分别加入1 mL ABTS溶液和100 μL梯度样品溶液混匀，静置6 min，吸取上清液200 μL在酶标板上进行点样，以无水乙醇作为空白对照，在λ=734 nm处测量各实验组的吸光度。每组做三个平行组，使用公式(5)计算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(5)

式中：A1为对照组吸光度；A2为样品组吸光度。

1.4.4.4 对超氧阴离子自由基清除能力的测定

取10 mL EP管编号，分别加入3 mL的浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)和不同稀释浓度的酵素样品1 mL，充分混合均匀在25 ℃的恒温水浴锅中水浴20 min后，加入同样预温至25 ℃的25 mmol/L的邻苯三酚0.4 mL，混合均匀后反应4 min，最后加入0.5 mL浓盐酸终止反应，在325 nm处测吸光度值A1，以蒸馏水代替样品，同样条件反应测A2，蒸馏水调零。每组作三个平行，使用公式(6)计算超氧阴离子自由基清除率。

超氧阴离子自由基清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

(6)

式中：A1为样品组吸光度；A2为本底吸光度；A0为空白对照吸光度。

1.4.5 草莓菠萝复合酵素体外抑菌活性研究

本研究以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌四种病原菌为指示菌，根据实验测量得到的抑菌圈直径大小来评估样品对不同病原菌的抑菌能力。取直径85.00 mm左右平板，每个平板倒入15 mL完成配置的LB琼脂备用。取200 μL病原菌菌悬液，用无菌曲玻棒使之均匀铺于培养基表面，然后将灭菌牛津杯(内径6.00 mm，外径7.80 mm，高10.00 mm)置于平板内，每板3只。用灭菌移液器分别将200 μL样品液、200 μL 10 mg/mL氨苄青霉素工作液(阳性对照)和200 μL无菌水(阴性对照)注入牛津杯内，将平碟盖好，置于37 ℃恒温箱培养24 h后用游标卡尺(精度为0.02 mm)量取抑菌圈大小，观察抑菌效果。平行实验三次，测量实验抑菌圈的直径，取三次平行实验结果的平均值作为最终结果。

2 结果与分析

2.1 草莓菠萝复合酵素功能营养成分

酵素品质的好坏与其内所含的化学成分密切相关。如图1所示，发酵6个月后获得的草莓菠萝酵素中总糖、总酚和蛋白质的含量分别从起初的0.65±0.044、0.06±0.002和0.10±0.005 mg/mL降低了75%、50%和80%。发酵过程中，微生物一般利用原料中的蔗糖、葡萄糖和果糖等单糖或双糖作为碳源。在发酵初期，微生物会利用水果自身的糖类和外源糖类进行生理活动，在适宜的发酵条件下微生物繁殖较快，并通过一系列代谢反应消耗了大量的可溶性糖，从而使总糖含量下降。从理论上讲，作为抗氧化物质的总酚，其在发酵过程中的含量应该表现为先上升后下降的趋势。因为发酵前期原料中酚类物质溶出，而随着发酵的进行，在有氧情况下被发酵液中酚类会被多酚氧化酶氧化，从而使酵素中总酚含量的降低。Yang等[13]在苹果酵素的研究中发现，总酚含量在发酵第21天达到最大值，之后持续下降。总酚含量的减少的可能是因为酚类化合物与发酵液中的蛋白质结合或吸附起来形成沉淀，导致离心后的酵素液中总酚含量变少或者是因为酚类化合物可以和发酵液中的有机酸发生反应，生成其他物质[14]。研究也表明，在发酵过程中一定浓度的酚类物质会抑制微生物的生长代谢，而微生物为了维持自身生长会降解酚类，从而使总酚含量降低[13]。发酵后期蛋白质对微生物的生理活动极为重要，此时糖类基本已耗尽，蛋白质作为氮源被微生物利用，也有可能在发酵过程中，微生物通过代谢活动产生蛋白酶，从而导致蛋白质含量的降低。在微生物的生长过程中，时常伴随着活性肽、短链脂肪酸和多糖等物质生成，糖类物质和营养物质减少，酚类物质被分解利用，最终转化为具有附加生物价值的物质如黄酮等具有良好生物活性的物质[15]，所以复合酵素中用来表征酵素抗氧化活性的一个重要指标黄酮类化合物从最初的0.07±0.004 mg/mL提高了63%。黄酮类化合物因结构的不同而具有不同的生理功能，当作为抗氧化剂时，可以提高机体清除自由基能力，减少组织细胞的氧化损伤并且可以调节DNA、蛋白质等物质的合成，免受衰老因子的损伤；当作为信号因子时，可以调节基因表达，改善衰老机体代谢情况[15]。因此，在草莓菠萝复合酵素中黄酮类化合物含量的上升的情况下，我们可以初步推测其具有清除体内自由基、延缓衰老的潜能。

图1 草莓菠萝复合酵素化学成分Fig.1 Chemical constituents of strawberry-pineapple complex Jiaosu注：未发酵指草莓菠萝混合果汁；发酵指草莓菠萝酵素，下同。 Note:Unfermented means strawberry and pineapple mixed juice; Fermentation refers to strawberry-pineapple Jiaosu.The same below.

2.2 草莓菠萝复合酵素的功效酶

蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶可以将大分子的蛋白质、脂肪和淀粉分解为小分子物质，从而更有利于肠胃消化吸收；而具有抗氧化作用的一种金属酶SOD可以清除机体产生的超氧阴离子，使后者发生歧化反应产生对机体无害的氧气和过氧化氢。由图2可知，发酵6个月后，草莓菠萝复合酵素中的淀粉酶、T-SOD和脂肪酶分别由起初的0.076±0.005、53.86±1.52和1.31±0.214 U/mL增加至0.086±0.006、95.57±4.58和6.24±1.781 U/mL。与Wang[16]、Zhang[17]等对青梅酵素和市售酵素的SOD活性测定分别为75.64 U/mL和41.7 U/mL相比，草莓菠萝复合酵素的SOD酶活力更高。并且在发酵后，T-SOD活力接近增加了一倍，因此本研究所得的复合酵素在体内具有很好的清除自由基的能力，具有很好的保健和美容功效；与Dong等[11]对火龙果酵素的脂肪酶活力测1.8±0.3U/mL相比，草莓菠萝复合酵素的脂肪酶活力较高，这说明草莓菠萝复合酵素对脂肪的消化能力更强。所以草莓菠萝复合酵素在医药、美容行业具有很大的推广应用价值。但其蛋白酶活力由起初的57.14±4.45 U/mL降低到2.67±0.57 U/mL，这便与前面蛋白质含量变化所一致，即蛋白酶活力的下降减少了对样品中蛋白质的分解能力，从而使其含量增加。分析原因可能是发酵过程中加入的酵母菌与乳酸菌大规模生长导致酵素pH值急剧下降，最终导致蛋白酶活力大幅度降低。

图2 草莓菠萝复合酵素功效酶活力Fig.2 Efficacy enzyme activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu

2.3 草莓菠萝复合酵素的体外生物学活性研究

2.3.1 草莓菠萝复合酵素对DPPH自由基的清除能力

本研究将发酵前后的样品用溶剂稀释成一定的体积浓度梯度(0.8%～10.4%)，由图3可知，各样品随着其体积浓度的增加对DPPH自由基(DPPH·)的清除能力也有所增加。发酵前样品对DPPH自由基的清除能力从6.44%±0.88%增加至96.24%±0.305%，发酵后的草莓菠萝酵素对DPPH自由基的清除能力从61.18%±0.23%降低至14.14%±3.08%。因此我们发现在微生物的生长过程中，样品中对DPPH自由基具有清除能力的物质被分解或消耗。Chen等[5]研究草莓酵素的抗氧化性变化发现酵素液对DPPH自由基清除率与发酵液中总酚含量具有相似的变化趋势，说明酵素对DPPH自由基的清除能力与酚酸类化合物之间有一定的相关性。所以发酵降低了样品对DPPH自由基的清除能力可能与发酵过程中酵素液中总酚含量下降有关。

图3 草莓菠萝复合酵素对DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on DPPH·

2.3.2 草莓菠萝复合酵素对OH自由基的清除作用

OH自由基(·OH)是活性氧中化学性质最活泼的自由基，它能够与活细胞中大多数具有还原性的生物大分子发生剧烈反应，是对机体危害最大的自由基。由图4可知，在实验浓度范围内(2%～14%)，样品对·OH的清除率呈浓度依赖性。发酵前样品对·OH的清除能力从34.10%±0.46%增加至59.99%±2.16%，发酵后的草莓菠萝酵素对·OH的清除能力26.74%±3.04%增加至85.91%±2.69%。Ng等[18]研究表明，黄酮类化合物对·OH有较好的清除能力，其清除能力的强弱取决于芳香环上羟基的数目和位置。由图1可知草莓菠萝酵素发酵后总黄酮含量提升为发酵前的三倍，在发酵过程中可能由于微生物的生长使发酵液中的酚类物质转化为黄酮类物质，同时导致了黄酮类化合物芳香环上羟基的数目和位置发生相应改变，最终使发酵后酵素对·OH的清除率变高。

图4 草莓菠萝复合酵素对OH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ·OH

2.3.3 草莓菠萝复合酵素对ABTS自由基的清除作用

ABTS自由基(ABTS+·)清除法被广泛用于生物样品的总抗氧化能力测定。在反应体系中，ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色的ABTS水溶性自由基，当其遇到自由基清除剂时，ABTS的颜色变浅，特征吸光度降低，吸光度越低。因此，通过测定吸光度的变化来体现对ABTS自由基的清除效果，结果见图5。

图5 草莓菠萝复合酵素对ABTS自由基的清除能力Fig.5 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ABTS+·

由图5可知，在ABTS测试体系中未发酵的样品和发酵后的草莓菠萝复合酵素清除ABTS自由基能力的差异显著。当体积浓度为2%时，未发酵的样品对ABTS自由基清除率为9.74%±1.60%，而发酵后的草莓菠萝复合酵素对ABTS自由基的清除率为4.28%±1.63%；且当体积浓度为14%时，未发酵样品的清除率65.32%±1.06%仍强于草莓菠萝酵素的清除能力23.52%±0.75%。Jiang等[19]对葡萄酵素天然发酵过程中体外抗氧化活性研究发现，总酚含量与ABTS自由基清除能力具有显著的相关性。发酵过程中ABTS自由基清除能力的变化可能与总酚含量的变化有关。由图1可知，未发酵样品中总酚含量为发酵后样品的两倍，且未发酵样品对ABTS自由基的清除能力约为发酵后样品的两倍，所以发酵后酵素对ABTS自由基清除能力下降可能是由于微生物的生长使发酵液中的酚类物质被分解，导致酚类物质的产量小于消耗量，最终体现为发酵后样品对ABTS自由基清除能力下降。

2.3.4 草莓菠萝复合酵素对超氧阴离子自由基的清除作用

由图6知，发酵后草莓菠萝复合酵素对超氧阴离子清除能力远远强于未发酵的样品。当体积浓度为10%时，未发酵样品对超氧阴离子的清除率为26.75%±1.54%，而此时草莓菠萝复合酵素的清除率已达到79.72%±1.17%。随着体积浓度的增加(20%～70%)，未发酵样品对自由基的清除率与体积浓度呈正相关，而复合酵素对超氧阴离子的清除能力趋于平稳状态。当体积浓度达到最大(70%)时，两者的清除率分别为45.58%±1.77%和98.34%±0.57%。Zhang等[20]研究表明，随着苯环上羟基数目的增加，黄酮类化合物抑制超氧阴离子的能力增强，并且SOD对清除超氧阴离子自由基也有着重要作用。由图2可知发酵后草莓菠萝复合酵素中T-SOD活力增加了近一倍，所以样品发酵后对超氧阴离子自由基的清除能力大幅提升可能与发酵过程中微生物产生大量SOD和多羟基取代或3羟基取代的黄酮类化合物的大量合成有关。

图6 草莓菠萝复合酵素对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.6 Scavenging activity of strawberry-pineapple

本研究采用常见的四种自由基体系对发酵前后的草莓菠萝复合酵素体外抗氧化能力进行较为全面的研究。结果发现，与对照相比，草莓菠萝酵素对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力增强，对DPPH和ABTS自由基的清除能力减弱。复合酵素对不同自由基清除效果表现出差异，这是因为抗氧化剂化合物可以通过不同的机制，在反应基质中每个有其特定的目标。因此，在各种化学测试不同的化学反应活性可能导致不同程度的抗氧化能力[21]。

2.4 草莓菠萝复合酵素的抑菌活性

如图7所示，发酵前的样品对四种病原菌均无抑菌能力而发酵后的草莓菠萝复合酵素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制效果，且抑菌效果为金黄色葡萄球菌(29.60±1.41 mm)>大肠杆菌(29.33±1.66 mm)>绿脓杆菌(27.67±1.34 mm)>枯草芽孢杆菌(14.63±2.11 mm)。发酵后样品抑菌能力增加可能与发酵过程中醋酸、皂苷和硫化物等物质的产生有关[22,23]，而且也可能与乳酸菌合成具有抗菌性能的代谢产物如乳酸和乙酸、脂肪酸、过氧化氢或双乙酰以及抗菌蛋白如细菌素肽聚糖水解酶等发挥抗菌作用有关[24]；而对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗菌活性较强，主要是由于有机酸中存在乙酸所致[25]。枯草芽孢杆菌细胞壁表面附有荚膜且能产生孢子，由此推测，具有抑菌特性的生物活性物质很难穿过荚膜作用于细菌内部，所以草莓菠萝复合酵素对枯草芽孢杆菌的抑制效果最弱。

图7 发酵前后草莓菠萝复合酵素的抑菌实验Fig.7 Inhibition experiment of strawberry-pineapple complex Jiaosu on bacteria注：A：10 mg/mL氨苄青霉素；S：样品液；H：无菌水。Note:A:10 mg/mL ampicillin;S:Sample solution;H:Sterile water.

3 结论

本实验通过乳酸菌和酵母菌复合发酵让发酵过程中产生的酸类物质和醇类物质尽量中和，使复合酵素口味和风味都得到了改善。复合发酵后草莓菠萝复合酵素中总黄酮含量提升1.5倍，对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均有较大提升，10.4%的草莓菠萝复合酵素对DPPH自由基的清除率达到58%，与Chen[5]报道的发酵30天后的草莓酵素对DPPH自由基的清除率相当，14%的草莓菠萝复合酵素对·OH的清除率高达88%，而Zhao[6]报道的56%菠萝酵素对·OH的清除率仅有60%左右，与Chen[5]对草莓酵素发酵后的羟自由基清除作用测定为除率达到最高值76.44%相比，草莓菠萝复合酵素的羟自由基清除率更高，20%的草莓菠萝酵素对超氧阴离子自由基的清除率已达100%，而Zhao[6]报道的70%的菠萝酵素对超氧阴离子自由基的清除率不到90%，并且在发酵后其T-SOD活力接近增加了一倍，脂肪酶活力大幅度提升。以上说明草莓菠萝复合酵素与草莓酵素和菠萝酵素相比具有更好的清除自由基的能力，能够在保健和美容方面发挥较好功效。草莓菠萝复合酵素融合了草莓和菠萝这两种水果各自的特性，取长补短，可以更全面地调理使用者身体。因此这种新型功能性酵素饮料不仅对人体清除自由基、分解大分子物质上具有一定的效果，而且在医药研发和化妆品等领域具有一定的推广应用价值，除此之外其还有助于加深人们对于天然功能性食品的进一步认识。