声门型喉癌组织中Survivin、八聚体结合蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移的关系

关玮豪 魏璐璐 许 欢

声门型喉癌原发于声带以上部位，如会厌、室带、杓会厌襞等，分化较差，发展较快[1]。本研究将通过研究声门型喉癌患者组织中Survivin蛋白、八聚体结合蛋白表达与分化程度、淋巴结转移的关系，从分子角度观察并确定患者喉癌的发展情况，早日为患者提供更精确的检查结果，并及时进行治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月至2020年5月在我院收治的118例声门型喉癌患者作为实验组，另选取同一时期于我院进行治疗的50例声带息肉患者作为对照组。纳入标准：①符合《喉癌外科手术及综合治疗专家共识》中对声门型喉癌及声带息肉的相关诊断标准[2]；②所选患者均知情并签署知情同意书。排除标准：①哺乳期或妊娠期女性；②依从性差，无法配合完成本研究；③病历资料不详细；④合并恶性肿瘤、精神系统疾病、心脑血管疾病病史者。实验组患者118例，男性95例，女性23例；年龄40～75岁，平均年龄(56.56±3.12)岁；其中低分化患者61例，中分化患者32例，低分化患者25例；有淋巴结转移患者52例，无淋巴结转移患者66例。对照组患者50例，男性38例，女性12例；年龄36～70岁，平均年龄(51.43±3.07)岁。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

采用免疫组织化学染色法测定Survivin蛋白表达水平：将118例声门型喉癌患者及50例声带息肉患者组织标本采用石蜡常规切片，切成4～5 cm切片标本后，置于涂好多聚赖氨酸的玻片上[3]。于68 ℃烤片机进行烘烤，持续4 min。于二甲苯及酒精中进行组织脱蜡，随后用蒸馏水连续冲洗3次，每次持续3 min左右，于PH值为7.4酸碱度下进行PBS冲洗3次，每次持续5 min[4]。在所选切片上需滴加3%H2O2溶液1滴进行孵育，持续15 min左右，结束后重复进行上述冲洗步骤。冲洗后于切片滴加Survivin第二抗体(雅吉生物，货号：IH-0615R)1滴，继续孵育30 min，PBS冲洗10 min左右[5]。所选切片于室温下逐个滴加DAB显色液，用实验室显微镜查看显色结果后进行自来水冲洗。所选切片逐个滴加苏木精进行复染1 min左右，自来水冲洗后返蓝10 min左右[6]。最后逐步进行梯度酒精脱水及二甲苯透明操作，采用中性树胶封片，于显微镜下观察染色结果。八聚体结合蛋白表达水平测定：同上述操作步骤，将上述操作步骤中Survivin第二抗体更换为鼠抗人Oct4 单克隆抗体(武汉纯度生物，货号：CDLG-4839)。

1.3 结果判定

先于低倍镜下观察切片，选取染色较均匀区域，再于高倍镜下选取5个不重叠视野范围，对每个视野范围进行细胞计数，规定每个范围内有100个肿瘤细胞方便后续统计及比较。根据每个区域内阳性细胞率及着色强度对5个区域进行评分[7]。阴性：仅细胞核核膜上着色为蓝色；阳性：细胞质及细胞核核膜上呈现明显浅棕色、棕黄色或深棕色。着色强度：着色结果为阴性、浅棕色、棕黄色或深棕色分别计分0、1、2、3分。阳性细胞率：每个视野范围内结果为阳性细胞总数占100个细胞数百分比，≤10%计0分，>10%～25%计1分，>25%～50%计2分，>50%计3分。每个区域内阳性细胞率及着色强度相加之和为蛋白表达水平：0分为不表达、1～2分为低表达、3～4分为中表达、5～6分为高表达，1～6分为阳性表达。

1.4 统计学方法

本研究数据的统计分析在spss22.0软件上进行，计数资料以例数(n)及百分率(%)表示，用χ2检验，采用spearman相关性分析2组患者组织Survivin蛋白、八聚体结合蛋白表达与分化程度、淋巴结转移的关系。检验标准α=0.05，当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 比较2组患者Survivin蛋白、八聚体结合蛋白阳性表达率

实验组Survivin、八聚体结合蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 比较2组组织中Survivin蛋白、八聚体结合蛋白阳性表达率(例，%)

2.2 实验组患者组织中Survivin蛋白阳性表达与病理特征的关系

实验组从高分化患者到中分化及低分化患者组织中Survivin、八聚体结合蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)；实验组有淋巴结转移患者组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平较无淋巴结转移患者显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 比较实验组各类别患者Survivin蛋白、八聚体结合蛋白阳性表达率(例，%)

2.3 实验组组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平与分化程度及淋巴结转移情况相关性

实验组组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平与分化程度呈负相关(γ=-0.306、γ=-0.325，P均<0.05)，与淋巴结转移情况呈正相关(γ=0.400、γ=0.309，P均<0.05)。

3 讨论

我国喉癌发病率为1.8～2.0/10万，占全身肿瘤1～2%，占头颈肿瘤3～8%(居第2位)。口腔进食或者空气进去以后，通过舌头、舌根到达会厌，会厌水平分成两条道，后面通过下咽、食道到达胃。会厌往前面走到声门，也就是发声的地方叫声带，再往下是气管、肺，这是一条呼吸通道[8]。声门型喉癌，就是发生在双侧声带上的癌。肿瘤转移主要包括原发癌细胞生长、新肿瘤血管生成、脱落并浸入细胞基质、形成癌栓、定位于人体各器官或组织进行生长至继续转移扩散[9]。

组织Survivin蛋白是一种细胞凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。Survivin 能够通过P21间接抑制Caspase，与细胞周期调控因子CDK4结合，导致 CDK2/cyclin-E激活和核糖体磷酸化[10]。核糖体磷酸化后启动细胞进入周期，加快G1/S期的转换，使P21从Survivin-CDK4复合物中释放出来[11]，与线粒体 pro-caspase-3结合，阻止线粒体释放Cyt-c，直接抑制了终末效应酶Caspase-3、Caspase-7，干预了Caspase-9的活性，抑制细胞凋亡[12]。同时survivin抵消了一大类凋亡刺激物的作用，包括IL-3、Fas、Bax、Caspase-3、Caspase -7、Caspase -8和TNF等[13]。人的Oct4基因位于6号染色体上(6p21.31)，长度为16.40 kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型，从而翻译成多种蛋白质[14]。Oct4对于人体维持干细胞正常功能及自我更新具有重要作用，有研究表明，肿瘤病变与肿瘤细胞分化程度及淋巴结细胞转移有显著关系[15]。本文采用免疫组织化学染色法，通过对比声门型喉癌患者与声带息肉患者组织Survivin蛋白及八聚体结合蛋白阳性率可知，组织Survivin蛋白及八聚体结合蛋白阳性率分别为26%和18%。提示组织Survivin蛋白及八聚体结合蛋白表达水平与声门型喉癌良恶性癌变的发生有关，可能参与了肿瘤细胞发展过程。本文结果显示，实验组从高分化患者到中分化及低分化患者Survivin、八聚体结合蛋白表达水平逐渐升高；实验组有淋巴结转移患者组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平较无淋巴结转移患者显著升高；组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平与分化程度呈负相关，与有淋巴结转移呈正相关。进一步证实，组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平不仅与声门型喉癌癌变发生过程相关，更影响着肿瘤细胞的癌变过程。癌变越严重，组织Survivin、八聚体结合蛋白表达水平越高，提示组织Survivin及八聚体结合蛋白对声门型喉癌患者癌变过程发生及发展的作用越强。Survivin及八聚体结合蛋白同样也预示着淋巴结是否发生转移，对癌细胞追踪定位或治疗后对患者后期疗效评估及预后预测具有重要作用。

综上所述，组织Survivin蛋白及八聚体结合蛋白表达水平与声门型喉癌良恶性癌变的发生及其发展密切相关，两者可鉴定患者声门型喉癌病情严重程度，为患者早期诊断及治疗提供微观分子病理基础。