高海拔酸菜中乳酸菌筛选与发酵特性研究

冶成君

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

中国酸菜的历史可以追溯到3000多年前的周朝，北魏贾思勰所著的《齐民要术》中有着详细记载[1]。而在一些国家，有着当地别具特色的酸菜品种，但多数被称之为“泡菜”。通常情况下传统酸菜是以自然发酵为主，通过附着在原料表面的微生物经过一系列生物化学变化制作[2]而成的，其中乳酸菌对于酸菜发酵起着举足轻重的作用[3]，酸菜原料经过乳酸菌的发酵而形成，并且使得酸菜具有酸、甜、香、脆等独特的风味[4]，最重要的是乳酸菌还能产生多种功能性成分，如共轭亚油酸、γ-氨基丁酸、胞外多糖等，有效地提高了发酵食品的营养功能价值[5]。另外，乳酸菌还具有调节肠道菌群和改善代谢综合症[6]，有助于人体消化防止便秘、抗肿瘤、降胆固醇，以及调节生理机能等医疗保健功效[7]。此外，酸菜本身具有酸咸的味道、口感脆嫩[8]、开胃提神，醒酒去腻，不但能增进食欲，还可以促进人体对铁元素的吸收[9]等生理功能。

近几年来，关于乳酸菌的特殊生理活性及营养功能正日渐被人们重视[10]，而研究表明传统自然发酵蔬菜中乳酸菌资源非常丰富[11]，且由于自然发酵的特殊环境使得乳酸菌在某些发酵特性方面尤为突出，对此研究人员对酸菜中的乳酸菌进行实验研究并应用于不同方面。

现今研究人员主要是从酸菜中筛选出具有优良发酵特性的乳酸菌，并用于发酵食品与医疗保健方面，在国内，张苏等[12]从酸菜汁分离乳酸菌和汉逊德巴利酵母菌发酵鹿肉；朱珺等[13]从四川泡菜样品中筛选出1株具有良好的胃肠道环境耐受能力的植物乳杆菌581，并用于多种果蔬汁发酵；王报贵等[14]从泡菜中分离出植物乳杆菌在非酒精性脂肪肝病的治疗中发挥着重要作用。在国外，VethachaiPlengvidhya等[15]通过DNA指纹分析进行了分析结果表明，在酸菜发酵过程中发现的乳酸菌种类比以前报道的要更加丰富；Nishida Satoshi等[16]从米糠泡菜中分离出副植杆菌乳杆菌11-1在家蚕细菌感染模型中的免疫活性及存活提高；Dong Joo Seo等[17]研究表明泡菜中某些乳酸菌对小鼠诺如病毒有抑制作用；Jung Eun Park等[18]发现从泡菜分离的乳酸菌可以抑制脂肪组织炎症的作用。

目前研究人员对于西式泡菜、韩国泡菜 、四川泡菜及东北酸菜的发酵过程中微生物区系已有很多系统的研究[19]，而对高原地区酸菜中乳酸菌的研究较少。高海拔地区自制酸菜中的乳酸菌在高原恶劣的自然环境，在自然淘汰及发酵过程中，具有优良发酵特性的乳酸菌菌群得以生存且资源丰富，而用于酸乳发酵中的乳酸菌发酵剂，菌种主要包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌[20]，菌株较为单一，且乳酸菌发酵剂的生产性能直接关系到最终发酵乳制品的性能，是影响产品质量的重要因素[21]，本研究从高原自制酸菜的各个部位中分离筛选出乳酸菌并对其发酵特性中的产酸性、耐盐性及耐亚硝酸盐性能进行研究，并用于牦牛酸乳发酵，通过对牦牛酸乳的感官与理化指标进行评价与测定并结合上述发酵特性的结果，挑选出适用于酸乳发酵的乳酸菌。该研究为高海拔酸菜中乳酸菌发酵特性的初步了解奠定了基础，也为酸乳的乳酸菌发酵剂提供菌株的选择。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸菜 青海省西宁市大通回族土族自治县桥头镇黎明小区居民家自制；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；脱脂乳粉 日本雪印株式会社。

LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；VS-860超净工作台 苏州工业园区鸿基科技有限公司；HF240CO2培养箱 上海力申科学仪器有限公司；H/T16MM台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；XH-C漩涡混合器 金坛市白塔新宝仪器厂；MDF-U3386S医用低温箱 普和希健康医疗器械(上海)有限公司；B10WAVEDA微量核酸蛋白自定仪 北京五洲东方科技发展有限公司；PE-06HD数字pH计 佐藤商事株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1培养基的制备

含9%CaCO3的MRS琼脂培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、琼脂14.0g、吐温801.0g、碳酸钙9g、蒸馏水1000mL，调节pH6.6，经121℃、15min灭菌。

MRS肉汤培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801.0g、蒸馏水1000mL，调节pH5.8，经121℃、15min灭菌。

1.2.2乳酸菌的分离纯化

分别取适当的菜根、白菜叶、菜茎、黄菜叶、菜水放入装有10mL的10%脱脂乳溶液中，36℃厌氧培养24h，当乳液发酵凝固后，在脱脂乳中进行5代纯化培养，使用无菌生理盐水将各个样品稀释至10-7稀释梯度，取稀释菌液0.2ml均匀涂布于含CaCO3固体培养基中进行分离。

1.2.3乳酸菌的筛选及形态鉴定

从分离得到的乳酸菌中筛选出长势良好、传代性能稳定的6株菌株：B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5，将6株乳酸菌进行平板培养挑取制作切片后利用显微镜初步观察乳酸菌的形态。

1.2.4产酸性的测定

实验采用pH法测定产酸性能，将经筛选得到并培养24h后的菌液充分震荡取10mL菌液于无菌管中利用数字pH计测定菌液的pH值。

1.2.5耐盐性的测定

将经过充分震荡后的菌液分别接种于添加了1%、3%、5%NaCl的MRS肉汤培养基中，在36 ℃下厌氧培养24 h，充分震荡后检测样品在600nm波长下的吸光度。

1.2.6耐亚硝酸盐的测定

将乳酸菌菌液充分震荡后分别接种于10mL含100mg/L、125mg/L、150mg/LNaNO2的MRS肉汤培养基中,并在36℃厌氧培养24h,充分震荡后并检测样品在600nm波长下的吸光度。

1.2.7还原牦牛乳酸乳的制备

称取牦牛乳粉40 g与160 mL水充分混合后放入高压灭菌锅进行65 ℃，30 min杀菌处理，杀菌完成后将牦牛乳液移液于无菌管中，每个无菌管装9ml牦牛乳液。将菌液充分震荡后取1mL加入到9mL牦牛乳液中，充分震荡后进行36℃培养12h。

1.2.8牦牛乳酸乳感官品质的评价

依据牦牛酸乳的色泽、组织状态、气味、滋味制定的一个牦牛酸乳感官评价标准，选择3名本专业有经验的评价人员采用三分制对牦牛酸乳进行评价，取3人评价分数总和为一份牦牛酸乳的评分，评价前后必须用温水漱口，并按评分标准对产品做出评定与评分。感官品质评价评分标准如下表1。

表1 感官评价与评分标准

1.2.9牦牛乳酸乳pH值的测定

将发酵12h后的牦牛酸乳样品充分震荡后取10mL于无菌管中，用pH直接测定样品的pH值。在测定时，每测定一个样品的pH值后需用纯净水冲洗并擦干电极。

1.2.10牦牛乳酸乳持水力的测定

取10 g牦牛发酵酸乳放入离心管中后，放入离心机，以3000 r/min离心3min后，除去上清液，称量残余物的重量 W，酸奶的持水力按下式计算

持水力%=(W/10)×100

2 结果

2.1 筛选乳酸菌菌落和菌株形态

纯化分离培养后对菌株经含CaCO3平板培养后挑选的菌落形态见表2。

表2 挑选菌落的形态

由上表可知在CaCO3培养基中菌落形态除J3-1、J3-4、H4-3、H4-4外均出现了透明圈，说明其余菌种都具有一定的产酸能力，为后续产酸性实验提供了一定的基础。经过接种于MRS肉汤培养基36 ℃厌氧培养后B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌株生长情况稳定良好，因此选用这6株菌株用于后续实验，显微镜初步观察6株菌株的形态后，经鉴定菌株均为单球菌，如图1所示。

图1 菌株的形态

2.2 产酸性分析

乳酸菌发酵形成的酸性环境对腐败菌具有较强的控制作用[22]，因此对乳酸菌产酸性的研究有着重要意义，而经36 ℃厌氧培养19 h后测定各编号菌液的pH值如下表3所示。

表3 菌液的pH值

在实验前测得MRS培养基的pH值为5.61，而接种后经过36 ℃厌氧培养19 h后，B2-1、B2-2、B2-4、J3-4的菌液pH值下降较快，其中B2-1 pH值为最低3.59，初步说明其在筛选后的6株菌株里产酸性能最好。

2.3 耐盐分析

通过使用微量核酸蛋白自定仪测得编号为B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌液经充分震荡后在不同NaCl浓度下于600 nm波长下的吸光度见表4。

表4 菌株在不同NaCl浓度下的吸光度

通过上表可以看出经挑选的菌株的吸光度值均随着NaCl浓度的升高而下降，从而反映出随着NaCl浓度的升高，菌株的生长变缓，NaCl有抑制菌种的生长作用。

2.4 耐亚硝酸盐分析结果

通过使用微量核酸蛋白自定仪测得编号为B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌株经充分震荡后在不同NaNO2浓度下于600 nm波长下的吸光度见表5。

表5 菌株在不同NaNO2浓度下的吸光度

通过表5可以看出B2-1、J3-4的菌液的吸光度值随着NaNO2浓度的升高而增加外，其他菌液的吸光度值均随着NaNO2浓度的升高而明显变化，说明B2-1、J3-4菌株在某一生长阶段，可降解且能利用NaNO2中的氮元素合成自身所需要的蛋白质，从而促进了菌株的生长。

2.5 还原牦牛乳酸乳的凝乳状态

实验菌种接种于还原牦牛乳中经12h厌氧培养后，各菌株凝乳状态见表6。

表6 牦牛酸乳的凝乳状态

2.6 牦牛酸乳感官评价结果

实验菌种接种于还原牦牛乳中经12h厌氧培养后，各菌株凝乳感官评价结果见图2。

图2 牦牛酸乳感官评价

据评价人员的评价菌株B2-1发酵的牦牛酸奶色泽均匀一致，成乳白色，有光泽，虽没有明显的酸乳独特的气味也无任何异味，口感适中，但由少量的乳清析出；B2-2发酵的牦牛酸奶除滋味上有不适的刺激性外与B2-1的其他方面评价相似；菌株B2-4发酵的牦牛酸奶无明显的酸奶的气味与滋味且有少量乳清析出；J3-4、H4-1菌株发酵的牦牛酸奶色泽均匀一致，成乳白色，有光泽，组织细腻，质地均匀，粘度适中，无乳清析出，但没有明显的酸乳独特的气味；H4-5菌株发酵的牦牛酸乳色泽均匀一致，成乳白色，有光泽，组织细腻，质地均匀，粘度适中，无乳清析出，具有浓郁的酸乳香味，无任何异味且口感适中，无不良滋味。菌株H4-5适用于发酵牦牛酸乳制品，B2-1次之。

2.7 牦牛发酵酸乳pH值的分析

实验菌种接种于还原牦牛乳中经过12 h发酵后的牦牛酸乳的pH结果见图3。

图3 发酵牦牛乳的pH值

2.8 牦牛发酵乳持水力的分析

6株菌株发酵的牦牛酸乳的持水力见图4。

图4 发酵牦牛酸乳的持水力

由6株菌株发酵的牦牛酸乳均有不错的持水力，通过凝乳状态的观察可知，由乳清析出的B2-1、B2-2、B2-4 的持水力低于未有乳清析出的其他3株菌株，其中感官评价最高的H4-5持水力是6株菌株中最高的。因此菌株H4-5作为酸乳的乳酸菌发酵剂有着良好的潜力。

3 讨论

3.1 筛选菌种

实验表明从酸菜白菜叶和菜茎中分离筛选菌株产酸性能最高，说明此处的菌株在酸菜的腌制过程中起主导作用。

3.2 筛选菌种耐盐性

B2-1的菌株在NaCl浓度为5%时吸光度达到了8.31，说明B2-1菌株具有良好的耐盐性，而其他菌株尤其是H4-1、H4-5的生长受盐浓度的影响较大，不利于奶酪或发酵肉制品的制作。

3.3 筛选菌种耐亚硝酸盐性

由于亚硝酸盐具有优异的发色和抑菌能力，所以它是一种在食品生产中特别是在肉制品制造业中常用的食品添加剂，但它却有致畸、致癌、致甲状腺肿大等危害[23]，因此在肉制品发酵时，应该选用具有良好的耐亚硝酸盐性与降解亚硝酸盐性的菌种，在泡菜发酵过程中，微生物将蔬菜中的硝酸盐氧化成亚硝酸盐, 同时蔬菜中的酚类物质和维生素C等物质也会将亚硝酸盐还原，但生成的亚硝酸盐大于被还原的亚硝酸盐，因此，随着发酵过程的进行，亚硝酸盐的含量会逐步上升[24]。因此B2-1、J3-4菌株可作为肉制品发酵与酸菜发酵的乳酸菌发酵剂。

4 结论

本研究从高海拔酸菜的各部位分离筛选出乳酸菌对其菌落进行形态初步鉴定，经-80 ℃、120 d保存后活化进行第二次筛选，从中分离筛选出6株传代性良好的乳酸菌：B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5，并进行了形态学观察、耐盐性、耐亚硝酸盐性、pH值的测定及还原牦牛乳发酵实验。结果表明：实验菌株初步观察形态均为单球菌，经发酵特性研究发现，在耐盐性生长实验测定中菌株B2-1在NaCl浓度为5%时，吸光度仍达到8.31，而其他菌株随着NaCl浓度的升高吸光度值迅速下降；在耐亚硝酸盐性生长测定中，6株菌株均具有良好的耐受力，其中菌株J3-4耐受性最好，在NaNO2浓度为150 mg/L下，吸光度达到21.27；菌株B2-1的液体培养基pH值最低为3.59；菌株H4-1、H4-5发酵还原牦牛乳后凝乳状态最好，感观评价分数菌株H4-1最高为32分、菌株B2-1次之为30分，发酵牦牛乳的pH值菌株B2-1最低为4.27、菌株H4-1的pH值为4.51，发酵牦牛乳持水力菌株H4-1最高达97%，菌株B2-1的持水力为90%。经综合评定菌株B2-1可用于牦牛乳奶酪发酵剂开发的候选菌株，菌株H4-1可用于牦牛乳酸奶发酵剂开发的候选菌株，菌株J3-4可用于发酵肉制品和酸菜发酵剂开发的候选菌株。