青海毛驴马腺疫病原菌的分离鉴定

黄荣，索佳佳，高楠楠，沈秀英，朱伟，董建宝

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁81000；2.山东畜牧兽医职业学院，潍坊261061)

腺疫记载于我国唐代综合性兽医学著作《司牧安骥集》中“槽结”，是一种由C型链球菌属马链球菌马亚种引起的急性接触性马属动物传染病，是世界范围内最常见的马属动物传染病之一[1]。该病以马属动物发热、上呼吸道炎症、喉囊和头颈颌下淋巴结肿胀化脓破溃为主要特征，发病率高，传染性强，幼驹死亡率较高[2]，感染后病原体很难被彻底清除[3]。

马链球菌(Streptococcusequi)包括马链球菌马亚种(Streptococcusequisubspeciesequi,S.euqi)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,S.zooepidemicus)[4]，马链球菌马亚种宿主特异性强，只感染马属动物，在感染宿主时主要通过鼻腔和口腔两个途径[5]，经口腔或鼻腔感染后侵袭扁桃体隐窝，短暂停留，感染后约3小时侵入头颈颌下淋巴结，48小时可到达黏膜固有层[6]。该菌对外界环境适应力较强，在水中可存活一周左右，在干燥的脓汁和鼻液中可存活数周，本菌不耐热，普通消毒剂即可将其杀灭[7]。

截至目前，关于马腺疫的报道大都为马的感染，有关驴发生腺疫研究较少，且未见有关于青海毛驴发生腺疫的报道。本研究以发生腺疫的青海毛驴为研究对象，对引发腺疫的病原菌进行分离鉴定，确定其致病菌为马链球菌马亚种，并对该菌进行了药敏试验，筛选出敏感药物，为该病的预防和治疗提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

使用棉拭子和细菌采样管采集发生腺疫的青海毛驴的脓性鼻液或破溃的淋巴结脓汁。

1.2 主要试剂及仪器

营养肉汤、5%绵羊血平板购自北京陆桥技术股份有限公司，DL2000 DNA Marker、Taq酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；细菌药敏纸购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1病原分离纯化与染色镜检

将无菌采集的病料分别涂片，进行美蓝染色镜检。病料分别划线接种于5%绵羊血平板，37℃培养20h后，观察菌落形态，挑取单菌落进行扩大培养和鉴定。

1.3.2PCR鉴定及测序分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取所分离菌落的DNA。参考《马腺疫检疫技术规范》(SN/T 2977-2011)中的PCR诊断技术对所提取的DNA样品进行核酸PCR扩增。使用Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)试剂盒，反应体系为25μL，组成如下：Ex Taq 12.5μL，DNA模板2.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，超纯水8μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳观察，1%的琼脂糖凝胶，电压80V～100V，电流40mA～50mA，电泳30min～40min。使用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒对阳性目的带进行回收，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸测序，将测序结果进行BLAST分析。

1.3.3药敏试验

采用标准K- B纸片琼脂扩散法，将37 ℃培养16 h～18h生长良好的分离菌液30 μL接种于营养肉汤琼脂平板，37 ℃培养16h后，检测分离菌株对青霉素、头孢噻呋、头孢噻肟、头孢西叮、氨曲南、多粘菌素B、红霉素、麦迪霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素12种抗生素的敏感性，按照说明书进行操作。

2 结果

2.1 涂片镜检和分离培养

对采集鼻拭子和脓汁样品进行美蓝染色镜检，显微镜视野可观察到圆形或卵圆形球菌，少数成对多数呈链状排列，几个到几十个球菌连成链(图1)，5%绵羊血液琼脂分离培养出现透明、中央微隆起、表面光滑、湿润黏稠的露珠样小菌落，且呈现β型溶血，即在露珠样菌落周围形成界限分明、完全透明的溶血带(图2)。

图1 样品美蓝染色镜检结果 图2 血琼脂平板培养呈现β溶血

2.2 PCR及测序结果

对分离纯化的细菌提取DNA，进行特异性PCR检测，结果显示本研究所采集的腺疫样品均为阳性(图3)。将阳性目的带进行DNA回收纯化和测序，对测序结果进行BLAST分析，结果显示PCR所扩增目的带的核苷酸序列为马链球菌马亚种的SeM基因的序列片段，确定所分离菌株为马链球菌马亚种。

图3 样品PCR检测结果

2.3 药敏试验结果

对本研究所分离的马链球菌马亚种进行药敏试验(K-B纸片琼脂扩散结果如表1)，结果显示β-内酰胺类药物(青霉素和头孢类)对分离株最为敏感。

表1 药敏试验结果

S表示敏感，R表示耐药，I表示中介。

3 小结与讨论

国际上对马腺疫的研究主要集中在马上，对驴发生腺疫的报道较少。2015年，Firew等人报道了埃塞俄比亚的驴发生马腺疫，并对驴发生马腺疫的临床症状进行了描述，对致病病原进行了分离和鉴定[8]。而我国对驴发生马腺疫的报道要远远早于其他国家，张八军于1990年首次报道了驴暴发马腺疫的情况，并详细记录了驴发病的临床症状、传播方式、预防和治疗方法等[9]。2018年以后，随着规模化养驴的兴起，规模化驴场暴发腺疫的情况被陆续报道[10-12]，研究表明规模化驴场各年龄段的驴均易感，但驴驹发病率和死亡率最高[2]，而且全国大部分的规模化驴场都有腺疫的发生，防控形势较为严峻。本研究对引起青海毛驴发生腺疫的病原进行了分离鉴定，证实了马链球菌马亚种为致病原，并对所分离的菌株进行了药敏试验。

在马腺疫的治疗方面，青霉素是目前公认的首选药物，而且截至目前尚未发现马链球菌马亚种的青霉素耐药菌株。本研究对青海毛驴的分离株进行的药敏试验显示，青霉素和头孢类药物为敏感药物，但在临床使用过程中青霉素性价比较高，在综合考虑的基础上建议使用青霉素进行治疗。

马腺疫是影响马属动物养殖业的主要传染病之一，也是世界范围内最常见的马属动物传染病之一[1]，该病对马属动物，尤其是幼龄马属动物的感染率和致死率较高，严重威胁着马属动物养殖业的健康发展[3]。青海毛驴是一种以役用为主的小型品种，主要生活在青海地区，虽然个体矮小，但具有适应高原艰苦的自然环境、抗病力强、耐粗饲和易管理等优点，是非常具有地方特色的优良品种。2021年1月13日，青海毛驴作为特色畜种，入选了国家畜禽遗传资源委员会办公室发布的《国家畜禽遗传资源品种名录(2021年版)》。近年来,青海毛驴的数量急剧减少，保护其品种资源变得非常重要，而在保种的过程中，疫病防控是重要的工作之一，马腺疫应当引起足够的重视。