西部旱区紫花苜蓿地土壤微生物群落结构和多样性分析

丁成翔

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

西部旱区是我国主要的紫花苜蓿种植区，该地区光合有效辐射高、生长季昼夜温差大等气候特点益于紫花苜蓿光合产物的形成和营养物质的积累，充足的水分供给可提高苜蓿草产量。土壤微生物作为重要的土壤肥力影响因素，加之高通量测序技术的飞速发展，土壤微生物群落结构和多样性特征分析逐步纳入土壤质量评估中[1]。土壤微生物在生态系统中扮演重要功能，参与养分的物质循环和能量流动[2]，不同土壤生境的微生物群落结构和多样性存在差异，进而影响土壤微生物功能。土壤养分影响土壤微生物生物群落结构和多样性，在粮食作物生产、草地生态系统已有较多研究例证[3]，区域气候条件和海拔亦是影响土壤微生物群落结构的主要环境因子。王艳廷等[4]研究发现，土壤物理特性改善能增加土壤微生物活性和未培养的微生物种类；谷永建等[5]培养试验发现降水显著改变了微生物量，从而影响阔叶林凋落物分解速率，同样结果在草地生态系统也得到了验证[6]；周煜杰等[7]应用文献计量学研究方法发现，不同生态类型土壤微生物群落的海拔分布规律不一致。当前在大空间尺度对土壤微生物研究报道多为天然草地、林地和荒漠等，对人工种植的苜蓿地的报道较少。因此，本试验将从研究区环境因素、土壤特性等角度探索苜蓿地土壤微生物群落结构和多样性，分析影响苜蓿地土壤微生物的关键因子，为苜蓿高产栽培技术与田间管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究区

研究区位于青海省乌兰县、内蒙古鄂尔多斯鄂托克旗和甘肃肃南裕固族自治县，所选试验点为当地紫花苜蓿种植地。乌兰县属干旱大陆性气候，平均海拔2960m，年平均气温3.5℃，年平均降雨量159.3～197.6mm，土壤类型为棕钙土；鄂托克旗属温带大陆性季风气候，平均海拔1365m，年平均气温6.4 ℃，年降水量为250mm，土壤类型为壤质沙土；肃南属高寒半干旱气候，平均海拔1300m，年平均气温为3.6℃，年均降水量254.8mm，土壤类型为壤质沙土。

1.2 样品采集

采样时间为2020年7月中旬，每个研究区紫花苜蓿核心种植地内随机选取6个采样点，各采样点相隔500m，每个采样点为1m×1m，使用直径8cm的土钻采用5点取样法采集土样，5个重复，采样深度为0-20cm，取样后将5个重复土样混合均匀。土样分为两部分保存，一部分保存在4℃中用于理化性质分析，一部分在-20℃保存用于高通量测序。此外，每个样点用环刀采集部分土壤用于容重分析。

1.3 土样分析

土壤理化性质的测定指标主要为土壤有机质、全氮、全磷、氨态氮、硝态氮、速效磷、速效钾、含盐量、含水量、容重、pH、土壤质地(粘粒、粉粒、砂粒)以及导水率。

将原状土置于150°C恒温烘箱中，烘干6～8h到恒重，称重测定其容重，每个测点容重为3个对照样组的平均值。土壤质地组成使用英国马尔文Mastersizer2000激光粒度仪湿法测定，将土壤颗粒有效直径按美国农部制标准分三个等级：粘粒(<0.002mm,%)、粉砂(0.05～0.002mm,%)、砂粒(2～0.05mm,%)。土壤养分按照鲍士旦编著的农化分析书测定[8]。

1.4 测序分析

样品按照MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit 试剂盒提取样品基因组DNA。以提取的样品基因组DNA为模板针对微生物 16S rRNA基因V4区(515F 与 806R)进行PCR扩增。Illumina MiSeq 平台进行高通量测序。

1.5 数据分析

通过QIIME平台去除原始序列中的低质量序列，根据标签序列分开来自不同样品的序列。利用Uchime软件去除在PCR过程中形成的嵌合体，获得的高质量序列用 Usearch方法进行聚类，以16S rRNA 基因序列97%相似度作为分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)的划分标准。通过RDP分类鉴定OTU代表性序列的微生物分类相对丰度。方差分析(ANOVA)用SPSS Statistics 19.0完成。α和β多样性采用vegan和picante包(R3.5.1)计算。

2 结果与分析

2.1 不同研究区土壤微生物群落结构

如图1a，在门分类水平上分析3个研究区土壤微生物群落组成，前10的细菌和古菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteriodetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)。在门水平上，不同研究区微生物分布差异较大，乌兰县研究地变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门丰度较高，鄂托克旗和肃南县研究地放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门的丰度较高。如图1b，在纲水平上， alpha变形菌门的丰度最高。表明不同研究区苜蓿种植地土壤微生物群落结构差异较大。

图1 原核微生物门水平和纲水平分类群落组成

3个研究区土壤微生物总OTUs数为8361个。其中，共同拥有的OTUs数633个，占总OTUs的7.6%；特有OTUs数量最多的是肃南研究地土样，2677个，占总OTUs的32%；最少的是乌兰县研究地土样，1780个，占总OTUs的21.3%；乌兰县与鄂托克的共有OTUs数为12.2%，与肃南的共有OTUs为10.7%；鄂托克与肃南的共有OTUs数为14.4%。表明鄂托克与肃南的苜蓿种植地土壤微生物群落结构更为相似(图2)。

图2 不同研究地苜蓿地土壤微生物韦恩图

2.2 alpha和beta多样性分析

3个研究区苜蓿种植地土壤微生物Alpha多样性指数分析表明，鄂托克旗土壤微生物香农维纳指数和系统发育多样性指数均最高，乌兰县的alpha多样性指数最低，且显著低于鄂托克旗的多样性指数，见图3a、3b。

图3 不同地区苜蓿土壤微生物alpha多样性分析

对3个研究区苜蓿种植地的土壤微生物分别基于bray-curtis距离和weighted-unifrac距离进行beta多样性分析发现，不同研究区的土壤微生物在pCoA第一轴和第二轴上明显分开，前两轴总共可以解释70.2%和72.7%的方差(图4a、4b)。分别基于这两种距离使用置换多元方差分析(PERMANOVA)，进行999次置换后发现，3个研究区两两之间均有着显著差异(表1)。

表1 beta多样性的置换多元方差分析

2.3 气候、海拔及土壤理化性质分析

对3个研究区不同因子分析表明，各因子间均存在显著差异。乌兰县海拔高于鄂托克旗和肃南县；鄂托克旗土壤容重和粉粒占比高于其他两个研究区，肃南的土壤粘粒和砂粒占比最高。在土壤养分方面，3个研究区土壤有机质无显著差异，土壤全氮、全磷、有效磷、有效钾、氨态氮和硝态氮含量差异显著；鄂托克旗土壤pH值相比最高(见表2)。

表2 不同地区环境因子

2.4 不同因子与土壤微生物的关系

由图5可知，海拔和全氮是影响不同研究区苜蓿地土壤微生物alpha多样性指数最关键因子。海拔与微生物多样性指数呈显著负相关，全氮与微生物多样性指数呈显著正相关；全磷和速效钾也与部分多样性指数呈显著相关。

图5 土壤微生物alpha多样性与环境因子相关性分析

冗余分析发现，研究区各因子与72.5%的微生物群落变化紧密相关。其中，降雨量和微生物群落变化相关性最高，为0.67，显著相关；其次分别为研究区海拔、土壤粉粒占比、土壤全磷含量、土壤砂粒占比和土壤粘粒占比等。相较于土壤化学因子，区域气候、海拔及土壤物理因子对苜蓿地土壤微生物群落结构的影响更深。

图6 不同研究地各因子对土壤微生物群落结构冗余分析

表3 不同因子与土壤微生物群落的相关性分析

3 讨论

紫花苜蓿因其较高的营养和经济价值在我国西部干旱区广泛种植，种植区气候条件以及海拔差异较大。3个研究区中，鄂托克旗苜蓿地土壤的微生物香农维纳多样性指数、系统发育多样性指数均是最高；乌兰县苜蓿地的土壤微生物多样性最低。相关性分析表明，苜蓿地土壤微生物alpha多样性与海拔成显著负相关，乌兰县地处青藏高原，海拔较高，其微生物丰富度和多样性较低。王颖等[9]在高寒草甸研究结果发现，土壤微生物多样性随海拔变化呈单峰型曲线；刘秉儒等[10]对贺兰山林地土壤微生物多样性研究发现，随着海拔增加，微生物物种多样性呈增加趋势；厉桂香等[11]对微生物多样性的海拔分布格局综述认为，不同生态系统内微生物海拔分布格局具有多种规律，呈线性、单峰型或无变化的特征。这表明，针对不同植被类型的生态系统，土壤微生物海拔分布特征需要结合区域生态系统因子具体分析与解释。除海拔因素外，土壤微生物alpha多样性与土壤全氮含量显著正相关，该研究结论很好的解释了研究区乌兰县苜蓿种植地土壤全氮含量最低，其土壤微生物多样性亦最低的原因。该结论与徐润宏等[12]在青藏高原的施氮试验结果相似，表明随着氮沉降增加，土壤细菌多样性显著增加；吴勇等[13]在西北荒漠紫花苜蓿地施肥试验中亦发现，土壤全氮含量与土壤微生物量呈显著正相关。

与已有研究结果相似[14]，本实验结果表明，在土壤微生物群落结构门水平上，3个研究区苜蓿地土壤微生物相对丰度较高的分别为变形菌门、放线菌门和酸杆菌门。由于不同种类土壤微生物对干旱胁迫的耐受性不同，本研究中变形菌门和放线菌门丰度最高，这与其较强的耐干旱能力有关[15]。纲水平分析发现，相对丰度较高的为alpha变形菌纲，原因是紫花苜蓿作为豆科类牧草，alpha变形菌纲是根瘤菌的优势类群之一[16]。

有研究表明，土壤理化性质、海拔和区域气候特征影响土壤微生物群落结构组成[17]。本研究发现，3个研究区苜蓿地土壤共同具有的微生物OTUs数较少，小于总OTUs数的10%，说明 3个研究区特有的微生物OTUs数较多，大于总OTUs数的90%。同样种植紫花苜蓿，不同地域土壤微生物群落结构差异显著，原因可能是区域之间差异较大的环境因子，说明相比于地上植物因子，气候、海拔和土壤因子与土壤微生物关系更紧密；也有可能是由于研究区苜蓿地种植年限较短(<5a)，尚未对土壤微生物群落结构造成显著的影响[18]。此外，冗余分析结果发现，气候、海拔和土壤物理特征相比于土壤化学特征对土壤微生物群落结构的影响更深。

4 结论

综上所述，西部干旱区紫花苜蓿种植地土壤微生物群落结构和多样性差异显著，地域海拔和土壤全氮含量是影响不同研究区苜蓿地土壤微生物多样性关键因子，水分(降雨量)对苜蓿地土壤微生物群落结构变化特征有显著的影响效果，土壤质地相比土壤化学特征对土壤微生物群落结构和多样性影响更深，相互关系更紧密。