附子生物碱类成分分析及其抗肿瘤机制初探

陆超颖,丁梦磊,蔡淑慧,谢辉,张雯,狄留庆

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心,江苏 南京 210023)

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品,性热、味辛,首载于《神农本草经》,具有“破癥坚积聚”之功效[1]。中医临床广泛运用含附子的复方治疗肺癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤,如四逆汤、麻附益阳汤、参附注射液及复方三生注射液[2-5]。现代研究表明,附子生物碱类成分具有显著抗肿瘤药效[6-8]。然而,附子水煎液生物碱含量研究尚不清晰,抗肿瘤机制亦不明确。

生物碱类成分既是附子中有效成分,也是其毒性成分。汤剂为中医临床最常用剂型,对附子水煎液中生物碱进行定量可以更好地为附子临床药效与毒性评价提供参考与依据。本实验采用UPLC-MS/MS方法测定附子中生物碱含量,明确附子发挥药效的物质基础,对进一步揭示其抗肿瘤机制至关重要。由于附子生物碱种类众多,目前其抗肿瘤机制尚不清晰。基于中药成分的复杂性及作用的整体性,附子生物碱可能是通过多成分、多靶点、多途径发挥抗肿瘤作用,这与网络药理学的系统观相吻合[9]。然而目前尚未有运用网络药理学方法研究附子抗肿瘤机制的报道。本研究拟运用网络药理学预测其抗肿瘤机制,为附子抗肿瘤物质基础及临床应用提供参考。

1 材料

1.1 试药

黑顺片(批号：200630、200418、190927,产地：四川绵阳)购自永刚中药饮片厂,经南京中医药大学中药鉴定教研室刘圣金副教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品,本试验前期已按照2020年版《中国药典》的检测方法和要求对饮片进行检验,选出优质产地的饮片。其余试药见表1。

1.2 仪器

Thermo TSQ Quantis液质联用仪(美国Thermo Fisher公司);梅特勒-托利多X6百万分之一电子天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司);液体加热器(潮州市一壶百饮电器实业有限公司);Synergy UV系统超纯水仪(美国Millipore公司);CL21 R型高速离心机(美国Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS方法分析附子水煎液中生物碱类成分

2.1.1 色谱及质谱条件 Thermo TSQ Quantis液质联用仪系统,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～1 min,2%～20% B;1～5 min,50% B;5～10 min,50%～75% B;10～14 min,75%～100% B)流速0.3 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量2 μL。

质谱条件:采用ESI源,正离子模式检测;脱溶剂温度350 ℃;脱溶剂气流N2流速50 L·min-1;离子转移管温度325 ℃;正离子雾化电压3 500 V,扫描方式为MRM检测。12个生物碱类成分测定的离子对见表2,其总离子流图见图1。

表2 附子生物碱类成分质谱数据

图1 附子总离子流图

2.1.2 对照品溶液的配制 称取对照品适量,精密称定,用水配制成为浓度为1.758 8 μg·mL-1去甲猪毛菜碱、0.992 0 μg·mL-1新乌头原碱、0.991 0 μg·mL-1多根乌头碱、0.985 0 μg·mL-1乌头原碱、0.979 5 μg·mL-1宋果灵、0.537 5 μg·mL-1次乌头原碱、0.993 5 μg·mL-1附子灵、1.018 5 μg·mL-1尼奥灵、2.046 0 μg·mL-1苯甲酰新乌头原碱、1.039 5 μg·mL-1苯甲酰乌头原碱、0.965 0 μg·mL-1苯甲酰次乌头原碱、1.109 0 μg·mL-1次乌头碱的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取黑顺片饮片适量,加8倍量水,武火煮沸后,文火煎煮1 h,过滤取续滤液,重复上述操作,合并滤液,减压浓缩成含1 g·mL-1饮片量的药液,稀释500倍至2 mg·mL-1,为供试品母液。取供试品母液适量,加入等量甲醇,涡旋3 min后,离心15 min(14 000 r·min-1)取上清,即为供试品溶液。

2.2 网络药理学技术初探附子生物碱类成分抗肿瘤机制

2.2.1 附子生物碱类成分靶点预测 将12个附子生物碱成分通过PubChem网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索其SMILES结构式,并导入Swiss Target Prediction(http://new.swisstargetprediction.ch/)进行各个成分对应作用靶点的预测。再利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对筛选出的靶点进行基因名称规范。

2.2.2 肿瘤靶点基因筛选 在Gene Cards(https://www.genecards.org/)数据库中输入“Cancer”作为检索词,查找与肿瘤疾病相关的基因。

2.2.3 “成分-靶点”网络的构建与分析 运用韦恩图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),将成分与疾病的靶点取交集,得到附子中12个生物碱抗肿瘤的潜在作用靶点,并绘制韦恩图。根据得到的交集靶点推导出与之对应的附子生物碱成分,剔除不作用于这些靶点的生物碱。将数据导入Cytoscape 3.8.2软件,进行可视化处理分析,构建附子抗肿瘤的成分-靶点网络。

2.2.4 蛋白相互作用网络 将“2.2.3”项中所得到的附子治疗肿瘤的靶标基因导入STRING在线数据库(https://string-db.org/),构建靶标之间相互作用网络,条件设定为:物种(Homo sapiens),最小相互作用分数(medium confidence)为0.400 0。由此获得的蛋白相互作用数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理分析。

图2 各对照品质谱图

2.2.5 GO分类富集分析和KEGG通路分析 运用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/),在“Functional Annotation Tool”栏目中,输入药物与疾病交集的靶标基因,选择“Offcial-gene-symbol”与“Homo sapiens”,提交基因序列,在“Gene-Ontology”条目中得到BP、CC、MF结果表,在“Pathways”条目中得到KEGG结果表。选取P<0.05的条目进行整理分析,在“微生信”(http://www.bioinformatics.com.cn/)网站上绘制GO与KEGG通路富集图。

3 结果

3.1 附子生物碱成分质谱分析

如图2所示,依次为对照品去甲猪毛菜碱、宋果灵、多根乌头碱、尼奥灵、附子灵、次乌头原碱、新乌头原碱、乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱的色谱峰。

3.2 方法学考察结果

3.2.1 线性范围与定量限 取对照品储备液适量,用超纯水稀释为不同浓度梯度溶液,得到不同浓度的对照品溶液,按“2.1.1”项下色谱及质谱条件进样测定。以待测物的质量浓度为横坐标(X),待测物的峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程和相关系数。12个生物碱的回归方程、相关系数、线性范围的结果见表3。

3.2.2 精密度试验 将对照品母液稀释10倍,按“2.1.1”项检测条件进行分析,连续进样6针,记录各组分峰面积,计算其RSD值见表4。12个生物碱精密度RSD值均小于3.73%,表明该方法精密度良好。

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表3 生物碱类成分的回归方程、R、线性范围、定量限(LOQ)

表4 精密度、稳定性、重复性与加样回收率测定结果(n=6)

3.2.3 重复性试验 按照“2.1.3”项下供试品溶液的制备,平行制备6份供试品溶液,进样得12个成分峰面积,计算相应成分含量,通过含量计算其RSD值,结果见表4。测得其RSD均小于5.32%,表明该方法重复性良好。

3.2.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液,室温放置,分别于0、2、4、8、12、24 h进行分析,计算12个待测成分的RSD值,结果见表4。12个生物碱RSD均小于4.94%,表明12个成分的供试品在24 h内稳定。

3.2.5 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液,共6份,精密量取,加入各对照品,按照“2.1.3”项下制备供试品溶液,进行测定分级,计算各待测物质的平均回收率及RSD,见表4。12个待测物加样回收率在95.85%～103.14%之间,RSD均小于4.9%,表明该方法准确度符合要求。

3.3 饮片生物碱含量测定

按“2.1.3”项下方法,制备3批附子饮片供试品溶液。以“2.1.1”项下色谱及质谱条件,对3批附子饮片中的生物碱成分进行含量测定,具体结果见表5。含量较高的为单酯型生物碱(如苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱)和醇胺型生物碱(如新乌头原碱、附子灵、宋果灵)。其中单酯型平均占比59.07%,醇胺型平均占比29.48%。

表5 不同批号附子生物碱类成分含量测定

3.4 活性生物碱成分及治疗靶点

Swiss Target Prediction中12个生物碱共预测到254个作用靶点,去除重复靶点后有131个。GeneCards中疾病“Cancer”靶点共25 460个,选取相关性得分大于20的基因作为肿瘤疾病的靶点,共780个。药物靶点与疾病靶点相交后得到26个附子抗肿瘤的潜在作用靶点,韦恩图见图3,交集靶点信息见表6。进一步推导出与交集靶点相对应的附子生物碱成分共8个,分别为苯甲酰新乌头原碱、宋果灵、次乌头碱、附子灵、多根乌头碱、去甲猪毛菜碱、新乌头原碱、尼奥灵。提示这8个生物碱可能为附子水煎液中具有潜在抗肿瘤功效的活性成分。

图3 附子生物碱抗肿瘤韦恩图

3.5 “成分-靶点”网络的构建与分析

Cytoscape 3.8.2软件绘制出了“活性成分-疾病靶点”网络图,见图4。图中共36个节点,64条边。左侧矩形代表附子水煎液中8个具有抗肿瘤活性的生物碱成分,右侧椭圆代表这些成分的抗肿瘤靶点基因。靶点的颜色越深表示度值(Degree)越大,即此靶点所连靶点的数量越多。附子的8个生物碱中,宋果灵、次乌头碱、去甲猪毛菜碱、多根乌头碱为其中的关键抗肿瘤活性成分。宋果灵对应15个靶基因,次乌头碱对应5个靶基因,去甲猪毛菜碱对应4个靶基因,多根乌头碱对应2个靶基因,宋果灵的抗肿瘤活性最强。26个疾病靶点中,MTAP基因对应4个活性成分,ABCB1基因对应2个活性成分,表明这两个基因可能为附子生物碱抗肿瘤的关键作用靶点。

表6 附子生物碱抗肿瘤潜在靶点与对应活性成分

3.6 核心靶点蛋白相互作用网络

把在STRING数据库中得到的蛋白相互作用信息表导入Cytoscape 3.8.2软件,构建蛋白相互作用(PPI)网络图,见图5。使用Network Analyzer模块进行可视化处理分析,节点代表靶点,整个网络图中共有26个节点、103条边,平均节点度为7.92,平均局部聚类系数为0.747。图中颜色越深、形状越大的基因代表其度值(Degree)越大,在整体中处于核心地位。AKT1、EGFR基因在整个网络图中处于核心位置,MTOR、ERBB2、ESR1、PIK3CA次之。说明这些靶点基因可能在蛋白相互作用网络中发挥着关键的调控作用。

图4 附子生物碱抗肿瘤的“成分-靶点-疾病”网络

图5 附子生物碱抗肿瘤核心靶点的相互作用关系

3.7 GO注释分析与KEGG通路富集

DAVID数据库中,BP共富集到118条,以P<0.05为筛选条件共有90条;CC共富集到17条,筛选后有13条;MF共富集到42条,筛选后有34条。选取BP、CC、MF中排名靠前的功能条目进行绘图分析,GO注释分析图见图6。在生物过程层面上,这些核心靶点参与了磷脂酰肌醇介导的信号转导(Phosphatidylinositol-mediated signaling)、磷脂酰肌醇3激酶信号转导的调控(Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、炎症反应(Inflammatory response)等生物过程;在细胞成分水平上,主要涉及了质膜(Plasma membrane)、细胞核(Nucleus)、细胞质(Cytoplasm);在分子功能层面上,主要存在蛋白质结合(Protein binding)、ATP结合(ATP binding)、激酶活性(Kinase activity)等功能。

图6 附子生物碱抗肿瘤潜在靶点的GO富集分析(前10)

图7 附子生物碱抗肿瘤潜在靶点KEGG 富集分析的10条通路

KEGG中共富集到了71条通路,以P<0.05为筛选条件,共筛选到70条。按富集的显著程度选取排名靠前的通路进行绘图分析,KEGG通路富集图见图7。图中,颜色越深的点代表其富集程度越显著。缺氧诱导因子1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、肿瘤细胞中的中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)为其中较为重要的几条通路,另外还涉及到癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)的调控、胰腺癌(Pancreatic cancer)等疾病的发生发展。

4 讨论

附子中主要含有三类生物碱成分：双酯型生物碱如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱，单酯型生物碱如苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，醇胺型生物碱如乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱，其中双酯型生物碱是附子中活性成分，亦是其毒性成分。去甲猪毛菜碱、多根乌头碱、附子灵、宋果灵、尼奥灵为附子中含量较高的几种生物碱。研究表明,附子中双酯型生物碱(如乌头碱、次乌头碱)、单酯型生物碱(如苯甲酰乌头原碱)、水溶性生物碱(如尼奥灵)均有良好的抗肿瘤活性[10-13]。由此可知,这14种生物碱可用于全面评价附子生物碱抗肿瘤方面的药理活性。

目前对这些生物碱抗肿瘤研究,大多集中于双酯型成分,对单酯型、醇胺型生物碱与生物碱类成分研究较少,无法全面了解附子抗肿瘤的物质基础。本研究在测定过程中,发现3批饮片中乌头碱和新乌头碱含量低于百万分之一,故未将其放入测定项。含量测定结果表明,单酯型生物碱含量在总生物碱中占比最高,醇胺型次之,双酯型乌头碱类成分含量较低。课题组后期含药血清生物碱测定结果表明,醇胺型生物碱在血清中含量最高,说明煎煮可促进双酯型乌头生物碱转化,降低附子毒性而增加有效成分含量,提高临床煎煮液的使用安全性;进入体内的单、双酯型生物碱可能被进一步代谢为毒性更小的醇胺型生物碱,成为发挥抗肿瘤药效的关键性成分。本实验明确了附子药液中生物碱成分含量,可为附子后续入血成分的研究提供基础。

网络药理学研究表明,在生物碱成分与疾病相交集的26个靶基因中,我们推导出具有抗肿瘤活性的8个附子生物碱成分,其中宋果灵对应的疾病靶点最多,提示宋果灵可能为其中发挥抗肿瘤药效的关键性生物碱。在此26个交集靶点中,MTAP与ABCB1基因为附子生物碱抗肿瘤关键作用靶点。MTAP是一种抑癌基因,以往研究表明,MTAP在恶性肿瘤中经常会选择性缺失,其功能的缺失突变在癌症发病机制中至关重要[14-15]。ABCB1过度表达与肿瘤多药耐药密切相关,它可以通过泵出癌细胞的底物药物,显著降低某些抗癌药物的细胞内浓度,成为化疗主要障碍[16]。

核心靶点蛋白相互作用网络图中,发现AKT1、EGFR基因在整个网络图中处于核心位置,是最为重要的两个靶点蛋白。在许多肿瘤细胞中,AKT1过度表达和激活,调控细胞增殖和生长,参与细胞凋亡和代谢在内的多种过程[17-18]。EGFR为表皮生长因子受体,在不同形式的癌症中经常以高水平表达,促进细胞异常生长和分裂[19]。

GO注释分析中,26个核心靶点在生物过程层面上,参与了以磷脂酰肌醇介导的信号转导、炎症反应为主的生物学过程。磷脂酰肌醇信号通路可帮助细胞内物质转运,且在细胞生长、增殖及抑制细胞死亡等方面发挥重要作用。经磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径是人类恶性肿瘤中最常激活的致病级联信号之一,它的激活可以启动一系列下游信号以支持细胞生长和增殖[20-21]。在肿瘤发展进程中,炎症反应与其有密切联系:一方面,肿瘤可以诱导炎症反应,通过分泌细胞因子(如IL-6)、趋化因子(如CXCR1)和生长因子(如TGF-β)来刺激炎症的产生[22];另一方面,炎症反应也可以促进肿瘤发展,炎症信号可通过Tregs、未成熟髓细胞和其他抑制因子的作用,形成肿瘤微环境,诱导免疫抑制[23]。Zhang等发现,附子联合给药可显著降低放射治疗诱导生成的TGF-β与Treg细胞，抑制炎症反应、增加机体免疫功能，从而减缓肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长[24]。朱瑞丽等发现,附子中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱可以显著抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞中IL-6分泌,具有较好的抗炎效果[25]。由此说明附子生物碱可能通过调节PI3K信号通路与炎症反应,抑制细胞增殖分化,从而发挥抗肿瘤作用。

KEGG通路富集图中,缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、肿瘤细胞中的中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)是其中最为重要的3条通路。在肿瘤微环境中,缺氧应激反应经常被肿瘤细胞利用以促进其转移和发展,而HIF-1则是这一过程中的关键调节因子[26],它的激活有诱导肿瘤发生的趋势[27]。许多肿瘤的发生和发展已被证明是雌激素依赖性的[28]。雌激素可以结合相应受体ESR1、ESR2来刺激细胞存活、增殖或分化[29],通过干预雌激素信号通路可以调控肿瘤细胞凋亡[30]。生物体能量的主要来源依赖于中心碳代谢,包括磷酸戊糖途径、糖酵解途径以及三羧酸循环。肿瘤细胞可以利用糖酵解产物乳酸为燃料,促进三羧酸循环,使得乳酸盐在葡萄糖消耗期间可以支持细胞存活、维持肿瘤代谢[31]。在细胞凋亡早期,三羧酸循环中的重要组分细胞色素C会从线粒体内转移到细胞质,启动Caspase凋亡级联反应。邵鑫等人发现苯甲酰乌头原碱能使人肺癌A549细胞的Caspase-3表达增加,并诱导细胞凋亡[12]。

在附子抗肿瘤机制的现有研究中,认为生物碱类成分可以通过调节自噬与凋亡、上调抑癌基因、抑制P38 MAPK与NF-κB信号通路、调节免疫发挥抗肿瘤作用[32-36]。本文的网络药理学预测到附子生物碱抗肿瘤可能是通过干预MTAP、ABCB1基因,调控AKT1、EGFR蛋白表达,参与磷脂酰肌醇介导的信号转导、炎症反应、缺氧诱导因子-1信号通路、雌激素信号通路、中心碳代谢等途径来实现。目前研究证实双酯型生物碱如乌头碱具有这样的生物活性和作用机制,但由于附子饮片经水煎后,只有微量的双酯型生物碱可进入体内,故推测实际发挥抗肿瘤功效的成分为含量较高的单酯型与醇胺型生物碱,本研究的网络药理学亦揭示了两者的抗肿瘤潜力,然而目前对单酯型与醇胺型生物碱在本文预测所得机制方面的研究尚存在空缺,可以作为后续研究重点。本研究通过生物碱成分分析与网络药理学机制预测,可为附子抗肿瘤物质基础及其临床应用提供科学依据。