转甲状腺素蛋白对子痫前期的诊断和治疗作用研究

马晓鹏，曹广明，刘崇东

（1.首都医科大学附属北京佑安医院产科，北京 100069；2.首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科，北京 100020）

子痫前期是孕期常见的严重妊娠并发症，是目前孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一[1]，有文献报道其发病率约为12%[2]，在我国孕产妇发病率为2%～6%[3]。迄今为止，其发病机制尚未完全明确，任何单一的病因学说均不能解释其病因和发病机制[4-5]。为改善母儿预后，子痫前期的诊断及治疗是目前临床研究的热点问题。已有研究表明，转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）是子痫前期孕妇重要的差异性表达蛋白之一[6]。本研究使用亚硝基左旋精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）法建立子痫前期小鼠模型，通过分析TTR对子痫前期孕鼠及其子代病理生理变化的影响，为子痫前期的诊断及治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 试验动物准备 选取健康无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级CD-1雌性小鼠37只，雄性小鼠10只，体质量25～28 g，饲养于中国科学院生物物理研究所屏障系统内。选用8周龄左右的雌鼠和9周龄左右的雄鼠，于每天17:00将小鼠按照雌鼠∶雄鼠2∶1合笼过夜，次日晨8:00检查雌鼠有无阴道栓，发现阴道栓之日即认定为妊娠第1天。本研究经首都医科大学附属北京佑安医院实验动物伦理委员会审核并批准。

1.2 实验动物分组 按完全随机分组法将孕鼠分为四 组：对 照 组9只，TTR组8只，L-NAME组11只，L-NAME+TTR组9只。处理方法如下：对照组在妊娠第7～11天皮下注射生理盐水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理盐水100 μL；TTR组在妊娠第7～11天皮下注射生理盐水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔 注 射TTR 100 μg。L-NAME组 和L-NAME+TTR组用L-NAME法建立子痫前期小鼠模型：于妊娠第 7天开始行 L-NAME 50 mg/（kg·d）皮下注射，连续注射 5 d即妊娠第 11 天建立模型。L-NAME组在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理盐水100 μL；L-NAME+TTR组在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射TTR 100 μg。

1.3 小鼠血压及尿蛋白测定及血清中TTR的检测 从妊娠第6天开始，隔日对孕鼠进行血压测量，通过无创鼠尾血压计，利用尾套法测量小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压，每只小鼠采集6次血压值，最终以平均值作为当天的血压值。于妊娠第17天采用应激性排尿法收集小鼠尿液，将尿液常温瞬时离心，保存于－80 ℃冰箱，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行尿蛋白检测。小鼠妊娠第18天，用眼眶后静脉丛采血法留取血标本，将血标本于离心机中以2 000 r/min、4 ℃离心15 min，吸取血清于－80 ℃冰箱保存，用ELISA进行血清TTR检测。

1.4 子代发育情况比较 孕鼠妊娠第18天抽血成功后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，暴露子宫，见孕鼠子宫呈“Y”型、壁薄，两侧宫腔内可见鼠胎及胎盘。自子宫远端沿子宫血管网对侧剪开子宫，依次取出胎仔及胎盘，计数正常形态胎仔和胎盘数量。并将胎仔及胎盘置于分析天平上称取质量，精确至0.001 g。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料满足正态分布或近似正态分布且方差齐时行两独立样本t检验，不满足正态分布或方差不齐时行非参数秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕鼠血压情况比较 于小鼠妊娠第7天始皮下注射L-NAME后，子痫前期组（包括L-NAME组和L-NAME+TTR组）孕鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压与对照组比较，均出现了明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；妊娠第11天经过腹腔注射TTR后，L-NAME+TTR组孕鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压较L-NAME组均明显下降，以舒张压下降幅度更为明显，但各项血压值仍高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；TTR组孕鼠的血压与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1。

图1 各组孕鼠的血压变化

2.2 各组孕鼠尿蛋白水平比较 L-NAME组孕鼠的尿蛋白定量较对照组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；注 射TTR后 的L-NAME+TTR组 孕 鼠的尿蛋白较L-NAME组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；TTR组孕鼠尿蛋白与对照组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2。

2.3 各组孕鼠血清TTR含量比较 应用ELISA方法对各组孕鼠血清内TTR含量进行测定。结果显示子痫前期组孕鼠血清内TTR的含量较对照组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。当用TTR干预治疗后，L-NAME+TTR组孕鼠血清TTR水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），结合孕鼠血压以及尿蛋白的变化，表明TTR干预明显改善了小鼠的子痫前期样症状和尿蛋白异常。结果见图3。

2.4 各组子代发育情况比较 四组孕鼠均于妊娠第18天处死，见孕鼠子宫呈“Y”型，壁薄，两侧宫腔内可见胎仔及胎盘，见图4。记录各组孕鼠的妊娠数量，分离出胎仔与胎盘，见图5。结果显示：子痫前期组孕鼠的胎仔质量及胎盘质量均明显低于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05），L-NAME组可见死胎1例；应用TTR后的L-NAME+TTR组，其胎盘与胎仔质量较L-NAME组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），说明TTR可逆转子痫前期胎盘与胎仔质量的下调改变，见图6。

图4 待分离的胎仔与胎盘

图5 已分离的胎仔与胎盘

图6 各组孕鼠间胎盘质量（左）及胎仔质量（右）比较结果

3 讨论

子痫前期是妊娠期特有的一种严重并发症，其主要的病理、生理变化是全身小动脉痉挛，可导致母儿严重的并发症，目前仍是导致孕妇及围产儿患病及死亡的主要病因之一[7]。另有研究表明，子痫前期与产后成人心血管疾病的发生有关联[8]；暴露于子痫前期的子代，成年后血压及体质量指数增高的风险增加，发生脑卒中的风险增高[9]。因此，如何有效地预防和治疗子痫前期已成为目前全世界共同关注的热点问题。

子痫前期的发病学说众多，但任何一个病因学说都不能解释所有子痫前期的病因和发病机制，我们对子痫前期的发病机制还需进一步的研究。动物模型可以再现疾病的发生发展过程，为疾病的治疗及预防提供思路，是目前进行疾病发病机制、治疗研究的主要方法之一。L-NAME是一氧化氮合酶抑制剂，可使一氧化氮的合成减少，引起小鼠全身血管收缩，从而模拟子痫前期的主要病理生理改变[10]。本研究中应用L-NAME后，可见子痫前期模型组的孕鼠出现了明显的血压升高、尿蛋白增多、胎仔体质量减低等表现，有效地模拟了子痫前期的主要病理、生理表现。因此，无论是从孕鼠或是从其子代方面分析，这种建模方法是成功可行的，而且此法操作简单、重复性好，造模成功率高，故而可予以广泛应 用。

TTR最初被称作前白蛋白，于1942年首次在血清及脑脊液中被发现[11-12]。蛋白质组学研究中发现，TTR在子痫前期患者血清中的表达浓度明显下调[6]，后续研究发现，TTR在监测病情变化及对治疗反应方面也可能具有一定的意义：子痫前期病情越重，TTR下降的趋势越明显[13]，在诊断重度或轻度子痫期具有明确的意义[14-15]。

既往Nakashima等[16]的研究发现，子痫前期动物模型中血浆TTR值明显低于对照组，TTR以聚集的形式沉积在胎盘组织，并导致胎盘组织坏死、诱发胎盘功能障碍。本研究中，TTR在子痫前期孕鼠血清中的表达均明显低于正常孕鼠，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这可能是由于子痫前期的病理过程中，TTR蛋白四聚体变性转化为无活性的TTR单体而沉积于胎盘组织，不能行使其正常的生物学功能，导致细胞凋亡，加重胎盘功能减退，进一步导致胎盘分泌TTR水平、血活性TTR水平均下降[17-19]。另有学者通过小鼠实验也证实TTR可以抑制类似子痫前期的临床表现和（或）病理改变，包括新发病的蛋白尿、高血压、肾小球内皮增生及抗血管生成因子的生成等[20]。本研究结果还表明应用TTR干预后，可改善其血压及尿蛋白升高的变化，并可使胎盘及胎仔质量增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这说明外源性TTR对于子痫前期病理过程的逆转、改善母胎结局可能有积极作用。

综上所述，本研究提示TTR的表达下调对子痫前期可能具有一定的诊断作用，TTR在一定程度上可以逆转子痫前期导致的血压升高、尿蛋白升高等病理改变。另外，本研究还初步评价了TTR对改善母胎结局的疗效。这些有助于更深入地了解子痫前期的发病机制，从而为临床防治该病拓展新的思路。我们期待TTR作为新型的子痫前期的预测因子及治疗靶点在子痫前期的诊断和治疗中发挥重要的作用。