山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)铁结合蛋白A的原核表达与结构预测分析

张疏桐，田 鑫，胡天豪，孙筱峰，张 耕，程方俊，罗献梅，宋振辉,2*，郭建华,2* (.西南大学 动物医学院，重庆 402460；2.西南大学 医学研究院 免疫学研究中心，重庆 402460)

铁在动物机体生命活动中扮演着重要的角色，参与电子传递、DNA合成、氧气运输等重要的生命活动，是血红蛋白等动物机体中重要化合物的组成成分[1]。一些奈瑟氏菌科和巴氏杆菌科细菌可从宿主转铁蛋白(transferrin,Tf)、乳铁蛋白等铁络合物分子中获取铁离子[2]，具体过程是细菌外膜上的转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B，TbpB)与Tf结合，脱去其辅基后使Tf与跨细菌外膜的转铁结合蛋白A(transferrin binding protein A，TbpA)结合[3]，通过TbpA将铁离子转运至细胞周质空间，铁离子在细胞周质空间中被铁结合蛋白A(ferric binding protein A，FbpA)识别并结合，FbpA将铁离子递呈给内膜FbpB-FbpC复合体，再将铁离子转运入胞浆[4]。由此可见，FbpA在细菌铁代谢及毒力作用过程中发挥关键作用。

海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)为巴氏杆菌科比伯斯坦杆菌属细菌，为人兽共患菌，可引起人面痈、脑脓肿、肺部感染及山羊发热、呼吸急促、反复咳嗽、肺部出血性坏死等疾病，具有重要的公共卫生学意义[5]。相关研究表明，在巴氏杆菌科、奈瑟氏菌科等一些革兰阴性菌中含有的FbpA能够结合细菌周质空间中的Fe3+，是细菌获铁的重要途径，为细菌毒力发挥中不可或缺的关键环节[6]。生物信息学分析显示，海藻糖比伯斯坦菌含有FbpA，但其结构和功能尚不明确，需通过结构预测进一步分析。

本研究基于本课题组对山羊源海藻糖比伯斯坦菌TbpB的相关研究，对FbpA进行了原核表达和结构预测，为进一步探究FbpA在山羊源海藻糖比伯斯坦菌铁吸收中的作用及山羊源海藻糖比伯斯坦菌的致病机理相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源2018年3月，本实验室从重庆市荣昌区某羊场肺部感染死亡羊只体内分离纯化得到1株细菌，编号为grc184，经生理生化试验、16S rDNA、白细胞毒素蛋白、RNA聚合酶β亚基序列分析等方法鉴定其为海藻糖比伯斯坦杆菌[7]。将该菌株接种于含有10%无菌脱纤维兔血的琼脂培养基，于37℃恒温培养24 h，挑取单菌落接种5 mL BHI(brain heart infusion，脑心浸出液肉汤)培养基37℃、220 r/min恒温振荡培养24 h后用于DNA提取。

1.2 引物设计与PCR扩增取3 mL菌液，按照OMEGA公司的E.Z.N.A.®Bacterial DNA Kit说明书，提取该菌株基因组DNA。根据fbpA基因两端的保守序列设计1对特异性引物：fbpA-F：5′-CCGCGGATCCATGAAAAAATCCC-3′；fbpA-R：5′-GCGCAAGCTTTTATTTTGCATCAAAC-3′。引物由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。以该菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得fbpA基因序列。反应体系：Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL(约100 ng)，ddH2O补至25 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保温。

1.3fbpA基因的序列特征与进化分析将PCR扩增产物送至重庆擎科兴业生物技术有限公司进行测序，并将测序结果由DNA序列转换为氨基酸序列，与NCBI数据库中流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、副猪嗜血杆菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的FbpA序列一起通过生物信息学软件MEGA 7.0构建N-J系统发育树。

1.4fbpA基因的克隆取1.2中的PCR扩增产物，经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切12 h，用PCR产物回收试剂盒回收纯化酶切产物，与用同样内切酶切割后回收的pET28a载体片段用T4DNA连接酶在16℃连接16 h。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100 μL转化后菌液，均匀涂布于含100 mg/L氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养16 h；挑取生长良好的单菌落接种于5 mL LB液体培养基(100 mg/L Amp)中，37℃、220 r/min恒温振荡培养12 h。取0.5 μL菌液，加入Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL及1.2中的上、下游引物各1 μL，用ddH2O补至25 μL，按照1.2的PCR反应条件进行PCR鉴定，选取阳性克隆菌株扩增培养并提取质粒进行序列测定，将序列正确的质粒命名为pET28a-fbpA。

1.5 FbpA的表达按照OMEGA公司E.Z.N.A.®Plasmid DNA Mini KitⅠ试剂盒操作说明提取重组质粒pET28a-fbpA，将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种于自诱导表达培养基ZYM-5052(STUDIER FW,2005)中[8]，37℃、220 r/min恒温振荡培养过夜，表达目的蛋白。

1.6 渗透休克法提取FbpA取20 mL1.5中过夜培养的细菌充分混匀，4℃、4 000 r/min 离心20 min；收集细菌，加入10 mL含有40%蔗糖的30 mmol/L 的Tris-HCl(pH8.0)溶液，用吸管反复吹吸菌体，充分打散菌体，室温摇晃10 min； 4℃、4 000 r/min 离心30 min；弃上清，将离心管倒置于纸巾上，彻底吸干多余溶液后，迅速加入1.5 mL 5 mmol/L 的MgSO4溶液，用吸管反复吹吸沉淀，打散菌体，然后置于冰上20 min；4℃、4 000 r/min 离心30 min，小心吸取上清至1.5 mL离心管，即为Osmotic Shock溶液[9]，通过SDS-PAGE检测蛋白表达。

1.7 结构与功能预测将得到的山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌fbpA基因的核苷酸序列转换成蛋白质氨基酸序列，以已知的流感嗜血杆菌FbpA空间结构为模板，利用I-Tasser网站在线预测其空间结构，将预测的结构保存为pdb格式。根据得到的结构模型，通过PyMoL 2.3软件将山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA结构与已经发表的流感嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等菌的FbpA结构进行比对，分析预测海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA可能与铁离子结合的氨基酸位点。

2 结果

2.1fbpA基因扩增结果取5 μL PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳、GoldviewⅡ核酸染料染色后，结果如图1所示，在1 000 bp左右可见明亮条带，大小符合预期。

M.DL2000 DNA Marker；1.fbpA基因扩增产物图1 海藻糖比伯斯坦菌fbpA基因PCR扩增结果

2.2fbpA基因序列及其进化分析海藻糖比伯斯坦菌grc184株fbpA基因包含1 026个碱基对，编码341个氨基酸，略长于流感嗜血杆菌(332个氨基酸)，但短于猪胸膜肺炎放线杆菌FbpA(585个氨基酸)。进化树分析结果如图2所示，海藻糖比伯斯坦菌grc184株FbpA与溶血性曼氏杆菌FbpA相似性最高，二者序列一致性约为83%，海藻糖比伯斯坦菌FbpA与溶血曼氏杆菌、副猪嗜血杆菌FbpA形成1个分支，区别于人流感嗜血杆菌、人淋病奈瑟菌、人脑膜炎奈瑟菌、百日咳波氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌FbpA。

图2 海藻糖比伯斯坦菌FbpA N-J进化树

2.3 FbpA蛋白表达纯化后蛋白溶液经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色后，如图3所示，在37 kDa左右可见明显条带，与FbpA预期大小相符。

M.蛋白预染Marker；1.FbpA蛋白图3 FbpA SDS-PAGE结果

2.4 FbpA结构与功能预测通过I-Tasser网站在线预测海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA的空间结构，结果如图4所示，与已经报道的其他细菌FbpA一样，海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA有两个结构域(N-lobe，C-lobe)组成，借助两个反向平行β折叠将两个结构域连接起来。根据已经报道的FbpA与铁离子结合位点，结合序列分析，预测出在海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA中可能与铁离子结合的位点：图4中红色显示的164，221，222位酪氨酸，洋红色显示的32位精氨酸，33位谷氨酰胺，84位精氨酸与碳酸根离子一起与铁离子结合。这6个氨基酸空间结构上靠近，都位于两个结构域之间形成的裂缝中，连接两个结构域的β折叠充当柔性铰链，可通过旋转调节两个结构域的相对位置结合铁离子或释放铁离子。

图4 海藻糖比伯斯坦杆菌周质FbpA的空间结构预测

从海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA与铁离子直接结合的氨基酸放大图可见，FbpA通过这些氨基酸的氧原子与铁离子结合(图5)。红色显示的是酪氨酸，洋红色显示的是精氨酸，蓝色显示的是谷氨酰胺。

图5 海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA与Fe3+结合氨基酸放大图

3 讨论

目前，蛋白原核表达的主要诱导方式为IPTG诱导，但IPTG诱导需要对诱导条件进行优化，且诱导产生的融合蛋白浓度较低[13]，因此，本研究采用了自诱导培养基诱导蛋白表达。相较于IPTG诱导培养基，自诱导培养基需要加入磷酸盐、硫酸盐、铵盐、镁离子、金属离子、甘油、葡萄糖、乳糖等物质，其制备过程较为复杂，但其诱导后菌液的浓度和融合蛋白的表达量显著高于IPTG诱导培养基[14]。

渗透休克法是利用高渗环境使细胞收缩，同时利用EDTA螯合吸附外膜脂多糖表面上的金属阳离子,使细胞外膜受损,然后将收缩的细胞置入低渗环境中，由于渗透压的变化，导致细胞外膜破裂，释放周质蛋白。相较于传统的超声破碎法，本研究采用的渗透热休克法能够保证提取的细胞周质蛋白纯度，避免胞内杂蛋白混入[15]。

通过对流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、溶血曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)、和百日咳波氏杆菌(Bordetellapseudohinzii) FbpA-Fe3+结合位点的分析发现，结合Fe3+的氨基酸残基几乎全是酪氨酸和精氨酸，且均与碳酸根离子或碳酸氢根离子一起与铁离子结合[16]。虽然海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA与哺乳动物Tf的一级结构只有20%的一致性，但它们的三维结构类似，都是由两个结构域构成，结构域间通过反向平行β折叠连接，它们的功能都是结合铁离子。流感嗜血杆菌FbpA的晶体结构和人Tf的晶体结构显示，它们结合铁离子的位点也是类似的[17]，这是由于协同进化的原因，所以细菌FbpA被称为细菌的Tf，只不过细菌FbpA结合的是穿过外膜的铁离子[18]。I-TASSER是由YANG等[19]开发的在线结构预测工具，本文通过I-TASSER在线预测了海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA三维结构，并根据已经发表的其他菌FbpA跟铁离子结合的氨基酸位点，预测了海藻糖比伯斯坦杆菌FbpA可能与铁离子结合的位点，分别是164,221,222位酪氨酸，32,84位精氨酸，33位谷氨酰胺，这些氨基酸在一级结构上虽然相差较远，但在空间结构上均位于蛋白质两个结构域的裂缝中，位置靠近，与铁离子配体结合，在动力学上是合理的，这个预测结果为进一步研究其功能提供了参考氨基酸位点。此外，KHAN等[18]研究发现，铁结合位点发生突变的FbpA结合Fe3+的能力有所下降，表明Fe3+结合位点氨基酸的变化对FbpA的功能有影响。

本研究运用计算机软件对原核表达的海藻糖比伯斯坦菌FbpA进行了结构预测分析，下一步会对其进行质谱分析、晶体衍射等试验，以验证结构预测分析的结果。