麦哲伦企鹅曲霉菌病的组织病理学观察和病原分离鉴定

宋志琦，孙艳明，苏 磊，屈亚锦，赵文杰，韩云林，秦 川* (．中国医学科学院 医学实验动物研究所 北京协和医学院 比较医学中心 国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室 北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，北京 0002；2.北京海洋馆，北京 0008)

真菌作为禽类的致病病原比较少见，大多为条件性致病菌。虽然真菌病相对不常见，但是它们对禽类宿主造成的损伤可能是致命性的，其中，曲霉菌病 (aspergillosis) 是目前最普遍的包括圈养企鹅在内的禽类真菌病，也是禽类重要的呼吸道疾病之一[1]。曲霉菌病是一种由曲霉菌属真菌感染引起的疾病，曲霉菌属由大约180种真菌组成，主要病原为烟曲霉菌、土曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌以及构巢曲霉菌等[2]。曲霉菌病的临床表现取决于累及的器官或系统以及感染区域是局灶性还是全身性。在禽类，曲霉菌病通常影响下呼吸道，在气囊和肺脏造成红肿病变或结节。其他相对不常见的临床病变可能累及眼睛、大脑、皮肤、关节和内脏等其他脏器[3]。随着企鹅的圈养和家禽现代化、集约化饲养模式的发展，以及广谱高效抗生素的滥用，抗生素对环境的污染，使禽曲霉菌病的发生率逐年上升。但是海洋馆圈养企鹅的曲霉菌病国内鲜有报道。

本研究对本实验室近期收诊的麦哲伦企鹅 (Magellanic penguins) 病例进行了系统的组织病理学观察和病原分离鉴定，以提供企鹅曲霉菌病的病理诊断特征和病原分离数据。麦哲伦企鹅作为重要的圈养观赏动物，其患病的诊断和治疗为其他同类动物的饲养和护理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料2019年初，中国医学科学院医学实验动物研究所实验病理分析平台收诊国内某水族馆送检的病死企鹅3只，均属麦哲伦企鹅，体质量为2.5～3.5 kg。

1.2 临床症状观察、剖检和组织病理学切片制作按照常规的传染病规范要求进行流行病学调查和临床观察。对死亡企鹅进行病理剖检，观察临床病变并记录，分别取肺脏、结节、心脏、肝脏、肠道和肾脏等脏器，于10%福尔马林中固定[4]。固定的组织经石蜡包埋后制作切片，分别进行苏木精-伊红 ( hematoxylin-eosin,HE) 染色、六胺银 (gomori methenamine silver,GMS) 染色和PAS(periodic acid-schiff)染色，置Olympus显微镜下观察。

1.3 病原的分离鉴定用消毒后的器械进行取样，将脏器表面消毒后浸泡在无菌PBS缓冲液中，4℃保存，24 h内分离备用。用75%酒精对脏器表面消毒30 s，用无菌水洗涤3次，用无菌手术刀切取1～2 g 组织，用无菌研钵研碎，加入0.5～1.0 mL无菌水，均匀涂布于马铃薯葡萄糖培养基平板，于25～28℃，培养4～7 d，挑取单菌落，转接保存，备用[5]。转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列常用于真菌的鉴定和高通量测序，选用引物ITS4和ITS5用于真菌纯培养物的鉴定、引物ITS1和ITS2用作高通量测序[6-7]。对细菌纯培养物ITS序列进行测序后，通过BLAST软件在GenBank中查找同源序列并进行比对，通过Mega 5.0软件采用邻接法进行系统发育分析并构建系统发育树。

2 结果

2.1 病理剖检变化3只送检企鹅中，1只为2岁左右雌性企鹅，病程较长，体质量在2个月内由3.5 kg 降至2.5 kg，食欲废绝死亡。剖检时，皮下组织干燥，尸体消瘦；打开胸腔后，在气管两侧，肺脏周围可见大量卵圆形结节 (图1A，B，C)，结节质地硬实，切面磨砂感，呈乳白色，干酪样质感 (图1D)。结节成串生长，呈浅黄色，大小不一，被一层透明的包膜包裹 (图1E)，直径为2～10 mm (图1F)。其他内脏器官浆膜面散在大小不等黄白色斑点。

A.气管周围病灶；B.肺脏周围病灶；C.结节外观；D.结节切面；E.胸腔内串珠样结节整体情况；F.取样结节的直径测量图1 大体病变观察

2.2 组织病理学观察取各脏器组织，制备切片，HE染色显示，镜下可见含有病理性结节的肺脏组织呈现典型的特异性肉芽肿结构(图2A)。肉芽肿与肺脏组织边界清晰，内部为同心圆形一层层的均质红染的干酪样坏死区域，内含大量破碎的固有细胞和炎性细胞碎片。外围环绕丰富毛细血管网、成纤维细胞、单核细胞组成的肉芽组织，少见多核巨细胞和上皮样细胞(图2B)；六胺银染色显示，肉芽肿内部有深棕色曲霉菌菌丝(图2C)；PAS糖原染色显示，菌丝为紫红色(图2D)。尚未形成肉芽肿的固有肺脏结构遭到严重破坏(图3A)。企鹅肺组织大面积充血，毛细血管网络破坏，支气管、细支气管管腔内充满脱落的上皮细胞碎片和嗜酸性物质(图3B)。副支气管管腔内充满均质粉染的蛋白样渗出物，夹杂蓝染的碎片，小血管周围炎性细胞浸润。组织内到处可见脱颗粒(红色小颗粒)的异嗜细胞，肺房内充满大量炎性细胞和有核血细胞(图3C，D)。

A.肺脏结节的直径测量；B.肺脏结节HE染色(15×)；C.肺脏结节六胺银染色(GMS,400×);D.肺脏结节PAS染色(400×)图2 肺脏结节大体和组织病理学特征

A.肺脏三级支气管(HE,100×)；B.肺脏支气管(HE,100×)；C.肺叶边缘(HE,100×)；D.肺叶内三级支气管局部放大(HE,400×)图3 肺脏组织病理学观察

在镜下观察肠道浆膜处的病理性结节，可见肉芽肿结构主要分布在肠道浆膜层(图4A)。肉芽肿内部含有大量破碎的固有细胞、炎性细胞碎片和断裂的真菌菌丝或孢子结构(图4B，C)。外围环绕着丰富的肉芽组织，与肺脏不同的是，外围还排列有大量多核巨细胞和上皮样细胞，周围大量异嗜细胞，淋巴细胞聚集(图4D)。肝小叶结构不清，肝索结构不明显、汇管区和中央静脉没有明显的规律性，肝脏轻度淤血。在不同的区域，可见多灶性炎性细胞聚集区(图4E)。肠道固有层和黏膜层呈现增生性炎症，固有层大量炎性细胞浸润，肠绒毛肿胀变性(图4F)。

A.消化道(HE,25×)；B.消化道局部放大(HE,50×)；C.消化道肉芽肿结节局部放大(HE,200×)；D.消化道浆膜层(HE,145×)；E.肝脏(HE,100×)；F.肠道黏膜层(HE,100×)图4 其他脏器组织病理学观察

2.3 病原分离鉴定对所有病理样本同时进行了必要的细菌学检查，革兰染色没有发现细菌；抗酸染色未发现分支杆菌。对病灶样品进行高通量测序，发现细菌DNA含量太低，无法建库，间接证实细菌非主要病原。因此利用真菌ITS序列建库，经测序获得270个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)，其中OTU1含量最高，相对丰度为91%，属于烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)，OTU2相对丰度为7%，属于黄曲霉菌(Aspergillusflavus)，因此，可进一步确定该病灶主要由曲霉菌引起(图5，表1)。对病灶样品进行表面消毒，通过分离培养方法从企鹅肺部病灶共分离12株真菌，基于对纯培养物ITS序列的比对和系统发育分析方法，结合形态学特征，对这些菌株分别鉴定，发现它们属于6个种，其中烟曲霉菌分离频率最高，占分离菌株的33%(图6)。

图5 分离样品的PCR扩增(A)和高通量测序分析(B)

图6 基于ITS序列构建的系统发育树

表1 企鹅病灶处分离真菌的18S rDNA/ITS序列 BLAST比对鉴定结果

3 讨论

企鹅肺脏实质区域组成肺房的内壁衬以不完整的单层扁平上皮，上皮外侧由弹性纤维包绕，肺房底部形成许多小的隐窝，与肺脏毛细血管相通，正是由于这种结构上的特征，慢性损伤逐渐侵袭整个肺脏，各处的损伤严重程度不尽相同，最终发展为结节性肉芽肿性肺炎。本病例中，肺脏不同区域展现出损伤的不同阶段，有的区域以纤维素性炎症为主，有的区域以间质性炎症为主，随着病情加重，发展为慢性肉芽肿性肺炎，出现多灶性坏死区域，最终坏死区域

无法降解，被结缔组织包膜包裹，形成大小不一的结节性肉芽肿。因为呼吸系统为传染源的侵袭门户，病原可能由呼吸系统侵入，继而造成其他实质器官的损伤，并诱导慢性炎症或形成肉芽肿。

本研究对样品进行病原的分离与鉴定，确定该病由曲霉菌引起，主要病原为烟曲霉菌。对于圈养的企鹅，曲霉菌病的出现可能与企鹅自身患有多种传染病或慢性肾病导致的免疫力下降有关[8]，而且，该病的患病率与企鹅年龄有关，幼年时期相对易发病，成年后一般散发[1,9]。雌性企鹅一般4岁左右性成熟，本病历中2岁的企鹅尚未成年，免疫力相对较低，对该病易感。大多数临床上重要的真菌都可以通过产生孢子在空气中传播。曲霉菌种类众多，广泛分布于环境中，常存在于包括企鹅在内的禽类畜舍、饲料、环境土壤和墙壁等区域。曲霉菌在潮湿的环境中会加速繁殖，孢子数量也会增加。外界的曲霉菌孢子往往通过空气或饲料侵入动物体内[3]。曲霉菌一般为条件致病菌，在动物免疫力正常的时候，不一定会造成动物患病，但是当动物免疫力降低、环境潮湿或曲霉菌孢子数量增加的时候，曲霉菌可能迅速繁殖，致使动物患病[3]。另外，圈养企鹅和商品化家禽养殖过程中常使用抗生素，其中很大部分抗生素以代谢物或原药的形式，随粪便和尿液排出，最终进入周围环境，长此以往，对环境造成抗生素污染，可能使动物产生耐药性。因此，抗生素类药物在圈养企鹅和家禽养殖中的使用和管理，以及如何平衡抗生素的使用与环境生态的保护，需要更多标准化规范的约束和社会关注。一般情况下，曲霉菌病从呼吸道侵袭禽类，严重的时候也会累及其他脏器，本病例患病的企鹅也累及消化道等其他脏器，慢性炎症可能影响动物整个免疫系统，加重病情的发展。

临床上，早期的企鹅曲霉菌病不易被诊断发现，需以预防为主[10]。饲养的时候，压力应激或环境改变可能也是该病的诱因。在繁殖和饲养企鹅的时候应该注意环境通风和严格的饲养环境卫生管理，减少压力应激和周围环境、空气温度及湿度的改变。本研究借助组织病理学观察，六胺银染色和PAS染色对企鹅曲霉菌病造成的病变进行了系统的观察，并对病原曲霉菌进行初步的病原分离，为企鹅曲霉菌病的临床诊断和企鹅的饲养管理提供数据支持。