TNF-α通过调控miR-363-3p/EZH2促进肺癌细胞增殖、迁移与侵袭

2021-10-29 00:44张琳琳陈影滕膈玲杨燕魏敏胡华
中国老年学杂志 2021年20期
关键词:腺癌靶向试剂盒

张琳琳 陈影 滕膈玲 杨燕 魏敏 胡华

(山东省胸科医院呼吸科,山东 济南 250013)

肺癌的死亡率和发病率在恶性肿瘤排行榜均居首位〔1,2〕。近年,肺癌在中国的发病率明显呈增加趋势。尽管医疗水平和新药均不断发展,使肺癌的预后得到改善,但晚期肺癌的预后及总生存率仍处于较低的水平。因此,提高肺癌的早期诊断及预后率具有重要意义。肿瘤坏死因子(TNF)-α为TNF的成员之一,其常作为免疫因子或炎性因子在实验及临床上应用〔3〕。TNF-α也参与调控肿瘤的发生发展,如其可可诱导增殖特异性转录因子FoxM1表达,通过调节FoxM1/活性氧/低氧诱导性因子(HIF)-1途径导致肝癌细胞增殖及凋亡抑制〔4〕。但TNF-α在肺癌中的作用及机制研究甚少。miRNA是在转录及转录后水平调控基因表达的单链、长度在19~25 nt的小分子RNA〔5〕。miR-363-3p已被证实在多种癌症中发挥功能,但其在肺癌中miR-363-3p的作用机制尚未完全阐明。组蛋白甲基转移酶(EZH2)为组蛋白甲基转移酶,为多梳基因蛋白家族的关键成员〔6〕。大量研究证实,EZH2在癌组织中表达异常升高,且与癌症的恶性程度呈正相关〔7〕。但EZH2在肺癌中与miR-363-3p和TNF-α的作用关系尚未见报道。本研究着重分析TNF-α对肺癌细胞生物学行为的影响,揭示其机制与miR-363-3p/EZH2通路的关系。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞A549购自ATCC;EZH2兔抗人单克隆抗体、TNF-α兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司;免疫组织化学试剂购自北京中杉公司;LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自大连Takara公司;Transwell小室、基质胶购自美国Coming公司;放射免疫沉淀蛋白裂解液(RIPA)、电化学发光(ECL)发光液均购自碧云天生物技术公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2细胞培养 A549细胞接种到含10%胎牛血清+90%DMEM培养皿置于37℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养。

1.3免疫组织化学实验 将肺癌组织、癌旁组织置于4%甲醛磷酸盐缓冲盐水中固定,然后脱水,石蜡包埋,连续切片(4 μm厚)。用兔单克隆一抗和酶标抗兔二抗孵育后检测TNF-α蛋白。DAB显色5 min,在显微镜下掌握染色程度。然后用苏木精复染2 min,脱水并封片。切片用光学显微镜(400×)进行评估。阳性细胞率=(阳性细胞数/癌细胞总数)×100%。阳性细胞率≥ 50%判定为阳性。

1.4细胞转染和分组 分别用含0、10 nmol/L的TNF-α处理A549细胞,分别为对照组、TNF-α组。参照LipofectamineTM2000说明书分别转染miR-363-3p mimics、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-363-3p至A549细胞,标记为miR-363-3p组、miR-NC组、anti-miR-NC组、anti-miR-363-3p组。转染48 h后进行qRT-PCR检测miR-363-3p表达以检测转染效果。用10 nmol/L的TNF-α处理转染miR-363-3p mimics、转染miR-NC的A549细胞,标记为TNF-α+miR-NC组、TNF-α+miR-363-3p组。

1.5qRT-PCR实验 Trizol法提取组织样本、对照组、TNF-α组、miR-363-3p组、miR-NC组、anti-miR-NC组、anti-miR-363-3p组、TNF-α+miR-NC组、TNF-α+miR-363-3p组A549细胞总RNA。检测RNA浓度和纯度合格后,用逆转录试剂盒合成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书操作,获得Ct值,以2-△△Ct法计算miR-363-3p相对表达水平。每个样品重复3次,取平均值。

1.6Western印迹实验 向研磨组织、对照组、TNF-α组、miR-363-3p组、miR-NC组、anti-miR-NC组、anti-miR-363-3p组、TNF-α+miR-NC组、TNF-α+miR-363-3p组A549细胞中加入RIPA缓冲液,冰上裂解30 min,10 000 r/min离心10 min收集上清。将适量体积的5×上样缓冲液与4倍体积的蛋白样品混匀,煮沸10 min,然后进行电泳(电压90 V,时间100 min)。用半干转膜仪转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉25 ℃封闭膜2 h;加入EZH2抗体4℃孵育过夜。次日,加入Ⅱ抗25℃孵育1 h。加入发光液,显影,曝光。以EZH2与β-actin条带灰度值的比值表示EZH2表达水平。

1.7四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验 取适量1.2.2各组细胞,按20 μl/孔添加的MTT溶液(5 g/L),培养3.5 h弃上清,按150 μl/孔添加二甲基亚砜(DMSO),震荡使甲瓒溶解。检测490 nm吸光度(A)以表示细胞增殖能力。

1.8Transwell实验 用无血清培养基将各组A549细胞调整密度至105个/ml,取100 μl加入Transwell装置上室,取600 μl含血清培养基加入下室。培养箱孵育过夜后取出Transwell装置,擦去上室内细胞,甲醇固定小室膜下表面迁移细胞30 min,甲醇固定后用结晶紫染色。显微镜下随机选5个视野计数,取平均值表示细胞迁移能力。侵袭实验采用包被基质胶的Transwell小室,其他步骤参考迁移实验。

1.9双荧光素酶报告基因检测实验 将含有miR-363-3p预测结合位点的EZH2野生序列及不含预测结合位点的EZH2突变序列分别克隆psiCHECK2载体,构建重组质粒WT-EZH2、MUT-EAH2。将WT-EZH2+miR-363-3p mimics、WT-EZH2+miR-NC、MUT-EAH2+miR-363-3p mimics、MUT-EAH2+miR-NC分别转染A549细胞。转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒分析转染48 h相对荧光素酶活性。

1.10统计学处理 采用SPSS21.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1肺癌组织中 TNF-α、miR-363-3p和EZH2的表达 与癌旁组织相比,肺癌组织中TNF-α、EZH2的相对值均显著升高;qRT-PCR法检测组织中miR-363-3p的表达,与癌旁组织相比,肺癌组织中miR-363-3p的表达显著降低(均P<0.001)。见表1,图1。

表1 miR-363-3p在肺癌组织和癌旁组织中的表达

图1 TNF-α和EZH2在肺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2TNF-α(10 nmol/L)对肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响 与Con组相比,TNF-α组细胞活性(48、72 h)、迁移细胞量和侵袭细胞量显著升高(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 TNF-α对A549细胞增殖和凋亡的影响

2.3TNF-α对A549细胞中miR-363-3p和EZH2表达的影响 与Con组相比,TNF-α组细胞EZH2 mRNA和EZH2蛋白表达显著升高,miR-363-3p表达显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表3、图2。

图2 Western印迹检测EZH2蛋白水平表达

表3 TNF-α对A549细胞中miR-363-3p和EZH2表达的影响

2.4miR-363-3p过表达对A549细胞增殖和迁移侵袭的影响 与miR-NC组相比,miR-363-3p组细胞活性(48、72 h)、迁移细胞量和侵袭细胞量显著降低,miR-363-3p表达显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 过表达miR-363-3p对A549细胞增殖和凋亡的影响

2.5miR-363-3p靶向EZH2 Target scan预测到miR-195靶向SUZ12结合的可能性很高(图3)。与WT-EZH2+miR-NC组相比,WT-EZH2+miR-363-3p组细胞相对荧光活性显著降低(1.39±0.14、0.47±0.06,t=10.462,P=0.001);与MUT-EAH2+miR-NC组(1.43±0.11)比较,MUT-EAH2+miR-363-3p组相对荧光活性不受影响(1.02±0.10,t=4.777,P=0.009)。miR-363-3p组细胞中EZH2蛋白表达(0.11±0.03)与miR-NC组(0.56±0.05)比较显著降低(P<0.05);anti-miR-363-3p组细胞中EZH2蛋白表达(0.87±0.08)与anti-miR-NC组比较显著升高(0.51±0.05,P<0.05)。见图4。

图3 miR-363-3p与EZH2的靶向关系预测

1~4:miR-NC组,miR-363-3p组,anti-miR-NC组,anti-miR-363-3p组图4 Western印迹检测EZH2蛋白水平表达

2.6过表达miR-363-3p逆转了TNF-α对A549细胞增殖、迁移侵袭的促进作用 与Con组相比,TNF-α组细胞中EZH2蛋白表达、细胞活性(48、72 h)、迁移细胞量和侵袭细胞量显著升高;与TNF-α+miR-NC组相比,TNF-α+miR-363-3p组细胞中EZH2蛋白表达、细胞活性(24、48、72 h)、迁移细胞量和侵袭细胞量显著降低(P<0.05)。见表5、图5。

表5 过表达miR-363-3p逆转了TNF-α对A549细胞增殖、迁移侵袭的促进作用

1~4:Con组,TNF-α组,TNF-α+miR-NC组,TNF-α+miR-363-3p组图5 Western印迹检测EZH2蛋白水平表达

3 讨 论

表观遗传学是在不影响DNA序列的前提下,引起可遗传的基因变化或细胞表性变化,包括组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化等〔8〕。EZH2可通过核小体组蛋白H3K27的甲基化,对染色质构型及基因组稳定性产生影响,以改变细胞的生物学行为〔9〕。Frankel等〔10〕在肺腺癌的研究中用EZH2抑制剂JQEZ5治疗EZH2高表达的肺腺癌小鼠和人肺腺癌细胞发现,EZH2抑制剂在体内和体外均具有抗肿瘤作用。Liu等〔11〕研究发现,EZH2在结肠炎患者和结肠炎小鼠中均高表达,失活EZH2可增强小鼠对结肠炎的敏感性,而EZH2在肠上皮细胞中过度表达可增强小鼠对结肠炎的抵抗力,其机制为EZH2整合了TNFα/ NFκB信号传导的多方面作用,促进结肠炎的炎症反应。Zingg等〔12〕报道,在小鼠的抗-CTLA-4或IL-2免疫疗法期间,肿瘤内TNF-α产生和T细胞积聚导致黑素瘤细胞中Ezh2表达增加,这反过来沉默了它们自身的免疫原性和抗原呈递,Ezh2失活逆转了这种抗性并与抗-CTLA-4和IL-2免疫疗法协同作用以抑制黑素瘤生长。本研究运用免疫组织化学法检测了肺癌组织及癌旁正常组织中TNF-α和EZH2的蛋白表达表达发现,TNF-α、EZH2在肺癌中均为高表达,且TNF-α可促进肺癌细胞中EZH2的表达,这与其他癌症中TNF-α和EZH2的表达相呼应。

TNF包括TNF-α和TNF-β是最早发现细胞因子,其可引起肿瘤组织出血坏死。。TNF-α主要由活化的单核巨噬细胞产生,其在细胞增殖、分化及炎症中均具有重要作用〔13〕。TNF-α即可通过增强机体免疫力,发挥抑制肿瘤作用,也可通过促进肿瘤细胞增殖改变肿瘤微环境发挥促肿瘤生长作用,其对肿瘤细胞具有双向作用〔14,15〕。Rawnaq等〔16〕在胰腺导管腺癌(PDAC)的研究中发现,多功能生长/分化因子(MK)在PDAC中表达异常升高,且在胰腺癌的其他组织学亚型中存在差异表达,而正常胰腺细胞不表达,此外,敲减MK的体外研究揭示了其与增殖、迁移的关联,经过分析上游信号通路发现,TNF-α是PDAC中MK表达的主要诱导物。本研究用TNF-α处理肺癌细胞A549并用MTT法、Transwell法检测发现,TNF-α可促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

miRNA在肿瘤的发生发展中的调节作用已得到公认,其中miR-363-3p在多种癌症中均出现表达异常〔17〕。Wang等〔18〕在肺腺癌和癌旁正常肺组织的miRNA表达谱分析中发现,miR-363在肺腺癌和癌旁正常肺组织的表差出现明显差异,且其与淋巴结的转移相关。胡情保等〔19〕在非小细胞肺癌的研究中阐明,miR-363-3p在肺癌组织中的表达明显低于癌旁组织,而在癌旁组织中的表达高于正常组织,并且miR-363-3p的表达与淋巴结转移呈正相关。Wang等〔20〕证实miR-363-3p可抑制肺癌A549和H441细胞增殖和集落形成,且在小鼠肿瘤异种移植模型中验证了miR-363-3p的抗致癌功能,其机制与靶向PCNA有关。本研究发现miR-363-3p在肺癌组织低表达,这与Wang等〔20〕的研究结果相一致;功能分析显示,过表达miR-363-3p对A549细胞的增殖、迁移和侵袭均有抑制作用;miR-363-3p靶向负性调控EZH2蛋白表达;且过表达miR-363-3p可逆转TNF-α对A549生物学行为的影响。

综上,TNF-α可能通过下调miR-363-3p/EZH2通路促进肺癌细胞恶性生物学行为,这将为肺癌的预防和治疗提供依据。

猜你喜欢
腺癌靶向试剂盒
如何判断靶向治疗耐药
农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究
MUC1靶向性载紫杉醇超声造影剂的制备及体外靶向实验
毛必静:靶向治疗,你了解多少?
试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点
益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的影响
基于CLSI-M43国际标准改良的Mycoview-AST试剂盒检测性能评估
HIF-1a和VEGF-A在宫颈腺癌中的表达及临床意义
靶向超声造影剂在冠心病中的应用
GSNO对人肺腺癌A549细胞的作用