柑橘素对癫痫大鼠海马组织氧化应激因子及Caspase-9的作用

邵延萱 罗文哲 薛晴 李晶

(佳木斯大学 1 2018级临床医学5班，黑龙江 佳木斯 154007； 2基础医学院；3研究生院)

癫痫因为头部神经细胞同步化的高度放电(及细胞生物电异常)造成的一种发作性脑病。曾有学者指出〔1〕，氧自由基可参与癫痫的发作，其影响大脑正常功能的途径可能是通过改变线粒体代谢实现的。而可以最直接地反映体内氧化还原状态，就是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，其浓度改变可直接反映机体的氧化还原状态〔2〕。 半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9在细胞凋亡与坏死中可通过介导及执行死亡指令来发挥作用，癫痫发作同时伴有脑细胞的凋亡。作为黄酮类植物化合物的柑橘素，已有学者研究其可通过对抗炎症和自由基生成、增加雌激素和一氧化氮(NO)数目来增强心功能发挥心脏保护效果〔3〕，对糖尿病患者也有显著治疗效果。还可降低血糖、预防血栓、抑制消化性溃疡、氧化应激、肿瘤、炎症反应、出血等生物学效应〔4～10〕。本研究探讨柑橘素对癫痫大鼠海马组织氧化应激标志物 GSH-Px、SOD、MDA 浓度变化及Caspase-9的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性成年SD大鼠30只，体重180～220 g〔哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，合格证号SCXK(黑) 2015-001〕，依随机数字法分成空白组、癫痫组、柑橘素组各10只。研究经佳木斯大学伦理委员会(JMSU-227)批准合格，经1 w的适应性喂养后开始实验。

1.2药物、主要试剂和仪器 Sigma 公司购买的柑橘素和戊四氮(PTZ)；南京建成生物工程研究所购买的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)试剂；武汉博士德公司购买的兔抗 Caspase-9 多克隆抗体、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)及枸橼酸钠缓冲液、多聚赖氨酸；成都泰盟科技有限公司的BI-2000医学图像分析系统；日本三洋电器有限公司的医用超低温冰箱；上海安亭科学仪器厂生产的TGL-168高速台式离心机；宁波新芝科学仪器研究所的电动玻璃匀浆机。

1.3动物分组及制造模型 将适应性喂养后的大鼠随机分为空白组(0.9%氯化钠溶液灌胃+0.9%氯化钠溶液腹腔注射)、癫痫组(0.9%氯化钠溶液灌胃+PTZ腹腔注射)、柑橘素组(柑橘素溶液灌胃+PTZ腹腔注射)。给予剂量：50 mg/kg灌胃，35 mg/kg腹腔注射；连续28 d，每天固定时间段进行操作，观察并记录大鼠是否有癫痫发作及发作表现。灌胃前禁食以增加吸收效果。造模成功标准按大鼠行为学表现判定(Ⅱ级或Ⅱ级以上发作持续5次)。

1.4行为学改变 依据Racine 6级指标来判定：0级：无任何发作形式的表现；Ⅰ级：头部抽动或点头、咀嚼样动作；Ⅱ级：有间断性咀嚼动作，点头现象也频繁出现、有的上身会有像湿狗一样的抖动；Ⅲ级：双上肢或单侧上肢有颤搐、阵挛；Ⅳ级：双上肢抽搐并伴有直立动作；Ⅴ级：强直性阵挛与抽搐现象逐渐蔓延扩展到全身，严重时大鼠不能正常站立，甚至直接跌倒在地。

1.5海马组织中SOD、GSH-Px、MDA浓度 完成行为学监测后进行取材操作。按体重进行麻醉操作(麻醉药用戊巴比妥钠)，待麻醉稳定时断头处死，剪下鼠头，在预先冻好的冰块上迅速分离出大脑组织，并且严格按照大鼠大脑图谱结构中准确定位仔细分离好所需的海马组织，小心操作备用。漂洗血液用冰生理盐水进行，拿滤纸片把多余的盐水吸干净，配成 10%的海马组织匀浆液(海马与盐水比例为1∶9)，经离心后(10 min，3 000 r/min)取上清液备有。检测海马组织中3种因子的浓度严格按试剂盒说明书操作所有步骤。

1.6海马组织中Caspase-9阳性细胞数 海马组织免疫组化染色观察并计算阳性细胞数。分离出的海马用甲醛固定后石蜡包埋，加入Caspase-9一抗，待4℃过夜后加二抗、辣根过氧化物酶标记的工作液，经二氨基联苯胺(DAB)显色后复染(苏木素)，检测海马中的阳性细胞。光镜下看到胞核棕黄色即阳性细胞。视野下选择不重复的视觉区域范围，计算符合条件的胞核或胞质呈黄染的阳性细胞数目总数，取平均值。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.13组行为学改变 癫痫组一般会出现肌阵挛及缩头动作；而有的大鼠也有其他一系列全身或局部的状态表现：如口唇发绀、呼吸受抑、眼球充血、前后肢痉挛抽搐或全身强直阵挛发作。这些发作表现通常会发生在给予PTZ腹腔注射的3 min以后，大多数大鼠一般在给药后的7 min内基本可以表现出典型的行为学改变，即达到发作高潮阶段；多数大鼠症状会在20 min之内逐渐减轻至最终恢复安静状态。空白组没有行为改变。相对癫痫组，柑橘素组躁动或抽搐的程度明显缓解或减轻，发作的潜伏期也延长了。

2.23组海马组织中SOD、GSH-Px、MDA浓度变化 癫痫组海马组织中SOD、GSH-Px浓度较空白组显著降低，而MDA浓度显著增加(均P<0.05)；柑橘素组海马组织中SOD、GSH-Px含量较癫痫组显著升高，而MDA浓度显著下降(P<0.05)，见表1。

表1 3组海马组织中SOD、GSH-Px、MDA浓度的变化

2.33组海马组织中Caspase-9阳性细胞数变化 癫痫组Caspase-9阳性细胞数〔(31.98±2.47)个/视野〕显著多于对照组〔(15.37±0.45)个/视野〕；而柑橘素组Caspase-9阳性细胞数〔(19.86±0.54)个/视野〕显著低于癫痫组(P<0.05)。

2.4海马组织Caspase-9免疫组化染色结果 镜下可见空白组细胞整齐排列、呈正常形态、胞核染色也很浅，有较大的胞体；癫痫组阳性细胞数大幅增加，胞核染色深且不规则、有时会有胞核碎裂和聚集；柑橘素组较癫痫组阳性细胞数降低尤为明显。见图1。

空白组

3 讨 论

氧化应激是参与癫痫发病造成脑损伤的重要内在机制〔11,12〕，而细胞凋亡又是影响疾病进程的主要途径。癫痫时抗氧化系统和增多的氧自由基之间平衡失调，加快细胞凋亡进程。所以说脑神经细胞的有效保护方式可从对抗氧化应激入手。其中，抗氧化剂SOD可最直接反映机体抗氧化水平，它对细胞产生保护作用可因降低过氧化脂质产生，除掉一些超氧阴离子发挥作用。脂质自由基降解后的产物是具有毒性的MDA〔13〕，机体细胞损伤的严重程度可靠其浓度变化间接反映出来〔14〕。GSH-Px〔15〕能降低脂质过氧化作用对机体的损伤，还具备降解胆固醇过氧化物等生物学作用〔16〕。本研究说明柑橘素可抵抗脂质过氧化作用，双向调节抗氧化酶活性(上调SOD、GSH-Px；下调MDA)而起到脑细胞保护效果。其可能是由于SOD可把体内超氧阴离子除掉后使过氧化脂质减少生成，进而发挥了细胞膜的保护，减弱了这些自由基对大脑的损害〔17〕。

细胞凋亡通路的重要启动因子为Caspase-9，这其中又包含3个相互联系的通路：死亡受体(以Caspase-8启动)〔18〕、线粒体(以Caspase-9启动)〔19〕、内质网(以Caspase-12启动)〔20〕。本研究提示PTZ建立的癫痫模型诱发了Caspase-9被激活，而Caspase-9又和癫痫造成的凋亡现象有关。而柑橘素可通过介导细胞凋亡途径来达到保护神经细胞的效果。作为黄酮类植物化合物的柑橘素，有很大潜力和生物学作用，可改善心受损肌和动脉硬化、降低癌症细胞增殖与炎性因子浓度、消除自由基等。综上，柑橘素可能通过消除自由基生成、强化抗氧化酶活性、削弱细胞凋亡等方式对癫痫大鼠神经细胞发挥保护效果。