平肝补肾方对围绝经期综合征细胞模型ERK信号通路蛋白的调控

权兴苗 宋春侠 范丽洁 徐立伟 刘玉兰 王月

(1承德医学院附属医院中医科，河北 承德 067000；2河北中医学院)

围绝经期综合征(PMS)主要发生于绝经期女性患者，就诊主诉多为五心烦热，心悸失眠，烦躁易怒和心绪不宁，病情严重者可影响正常的生活和工作〔1,2〕。既往研究表明，祖国医学对于PMS有一定的疗效，二仙汤〔3〕和六味地黄丸〔4〕均可在一定程度上缓解PMS的临床症状，但效果有限。平肝补肾方是最新兴起的一种中医药治疗方案。主要针对肾虚的主要症状，其以温肾阳，滋肾阴，泻肾火为主，以适应阴阳俱虚于下的症状〔5,6〕。本研究以平肝补肾方为治疗方案，构建PMS细胞模型，观察其对PMS治疗效果。

1 材料与方法

1.1实验动物与材料 胎牛血清(FBS，BI公司，以色列)；DMEM培养液、AV-PI凋亡试剂盒及2.5 g/L胰酶Trypsin(Invitrogen公司，美国)；Trizol及逆转录试剂盒(Takara公司,日本)；实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)仪(Bio-Rad公司，美国)；Transwell试剂盒及CCK-8试剂盒(北京碧云天公司，中国)，以SPF级雌性离乳大小鼠30只为研究对象，体重(91.3±3.6)g，购自山东省济南市实验动物中心许可证书编号：〔SCXK(鲁)2016-0893〕。

1.2方法

1.2.1PMS细胞模型的构建〔7〕待雌性SD大鼠性成熟后，脱颈椎处死，放入盛有75%酒精的玻璃缸内，浸泡2 min以消毒。取至无菌洁净台，解剖刀处理SD大鼠，在无菌的条件下，把卵巢及周围附着的脂肪组织一并取出，迅速放入灭菌的25 cm2培养皿内，然后在超净台内用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗卵巢3次。解剖刀去除多余的脂肪、结缔组织和输卵管等附件，再次用含5%FBS的培养基冲洗1次，放入盛有培养基的培养皿中，在体视显微镜下用注射针头刺破卵泡，轻轻挤压，钢筛过滤，1 500 r/min离心，细胞计数仪计数；用0.4%的台盼蓝染色计数，细胞活率为(91.98±7.99)%。同时利用Transwell试剂盒的上室和下室，以105个/cm2细胞数接种于Transwell试剂盒下室，进而构建PMS细胞模型。

1.2.2平肝补肾药方配伍 方药组成：柴胡15 g，玄参15 g，生地10 g，熟地10 g，郁金10 g，白芍15 g，知母10 g，栀子15 g，地骨皮15 g，青蒿20 g，丹皮12 g，五味子15 g，夜交藤30 g，浮小麦30 g，甘草10 g。所有药物均经水煎。取汁待用。

1.2.3细胞分组 根据实验目的，将构建好的PMS细胞模型分成3组，即中药组，细胞给予上述平肝补肾药方处理，1 ml/孔，处理12 h；抑制剂组，即细胞在平肝补肾药方处理的基础上，增加细胞外信号调节激酶(ERK)5的抑制剂BIX02188处理，12 μl/ml，处理12 h；空白对照组，细胞加入等量PBS。

1.3细胞功能学分析 3组细胞经上述方法处理12 h后，利用胰蛋白酶进行消化和收集，接种于96孔板中。按照CCK-8试剂盒说明书要求，加入各试剂，孵育30 min后，450 nm波长酶标仪测定吸光度值，之后每30 min检测1次吸光度，直到4 h为止。按照AV-PI的试剂盒的说明书加入各试剂，流式细胞仪分析各组样本，计算各组凋亡率。

1.4细胞靶分子的定量分析

1.4.1qPCR试剂盒检测ERK5和凋亡因子表达 3组细胞经上述方法处理12 h后，利用胰蛋白酶进行消化和收集，加入1 ml Trizol 试剂，充分混合后，提取细胞总RNA，室温条件下根据逆转录试剂盒说明书，配制20 μl的逆转录体系，加入总RNA，37℃水浴箱孵育30 min，将总RNA逆转录为cDNA，-20℃低温冰箱保存。然后根据qPCR试剂盒说明书，配制50 μl的qPCR体系，加入cDNA和ERK5，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-6和Caspase-3的引物模板，ERK5：正义链5'-CAUAAUAGACGGGACUAGAATA-3'，反义链5'-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3'；Caspase-3：正义链5'-TTGCTAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3'，反义链5'-CCGATAAGCTCCGTTTCCTGGTTC-3'；Caspase-6：正义链5'-GTCGTATGCAGGTTTCGGTTGCTG-3'，反义链5'-TGTAAGCCGTGGCTCAATCCTCTC-3'；GAPDH：正义链5'-GCCTCTCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反义链5'-AAGCTGCTGGTGAAGAGCCAGTGGA-3'。置于Applied Biosystems PCR仪进行反应，设置条件按照说明书。统计并记录个样本CT值，利用2-△△CT的方法计算目的基因的相对表达量。

1.4.2Western印迹检测ERK5和凋亡因子表达 3组细胞经上述方法处理12 h后，PBS清洗后，加入2 ml RIPA细胞裂解液，冰上裂解和收集细胞碎片，加入PE管中，预冷高速离心机，4℃，12 000 r/min，收集总蛋白，加入10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，99℃煮沸，BAD试剂盒测定蛋白的分子量。按照说明书，配制10%分离胶和4%浓缩胶，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液浸没胶板，40 V电泳2 h后转染到硝酸纤维素膜，TBST洗膜后，过夜孵育ERK5，Caspase-3和Caspase-6的蛋白一抗，TBST液洗膜，常温孵育鼠抗山羊辣根过氧化物酶(HRP)二抗30 min，DAB显影，Image J 软件分析蛋白条带。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.13组细胞增殖能力比较 自第12小时起，中药组细胞增殖率均明显高于空白对照组，抑制剂组细胞增殖率均明显低于空白对照组和中药组(均P<0.05)，见表1。

表1 3组细胞的增殖率比较

2.23组细胞凋亡水平比较 中药组凋亡率〔(1.13±0.35)%〕明显低于空白对照组〔(5.13±0.91)%〕和抑制剂组〔(47.97±3.36)%，P<0.05〕；且抑制剂组凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)。

2.33组ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3 mRNA表达水平比较 3组ERK5 mRNA水平比较：中药组>空白对照组>抑制剂组(均P<0.05)，3组Caspase-6和Caspase-3 mRNA水平比较：抑制剂组>空白对照组>中药组(均P<0.05)。见表2。

表2 3组ERK5、Caspase-6、Caspase-3 mRNA相对表达量

2.43组细胞ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3蛋白表达水平比较 3组ERK5蛋白水平比较：中药组>空白对照组>抑制剂组(均P<0.05)；3组Caspase-6、Caspase-3蛋白水平比较：抑制剂组>空白对照组>中药组(均P<0.05)，见表3，图1。

表3 3组ERK5、Caspase-6、Caspase-3蛋白相对表达量比较

1～3：中药组,空白对照组，抑制剂组图1 Western 印迹检测Caspase-3、Caspase-6及ERK5蛋白表达

3 讨 论

PMS往往与机体内的激素水平改变相关。其主要症状为烦躁易怒，头晕目眩等〔8,9〕。流行病学统计结果表明，19%～30%的PMS患者可影响正常的工作和生活，治疗愿望迫切〔10〕。PMS主要与机体的激素水平相关，在绝经期，机体的雌激素急剧下降，造成了卵巢在短时间内急剧收缩，卵巢细胞大量凋亡，此为PMS发生的基础。本研究在此基础上探究平肝补肾药方对PMS细胞模型凋亡和增殖水平的影响，结果证明平肝补肾药方对PMS细胞模型的增殖和凋亡有调节作用。

ERK5是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)系统中的关键分子蛋白，其激活参与细胞的增殖与凋亡〔11,12〕。既往研究表明，ERK5参与机械牵张应力作用下软骨细胞的凋亡〔13〕，参与大鼠海马组织在缺氧无糖环境刺激下的过度凋亡〔14〕。可见，任何细胞外的化学信号，生物力学信号及缺氧信号等均可通过激活ERK5信号通路参与细胞凋亡和增殖。本研究说明平肝补肾药方通过激活ERK5的表达，促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡。

Caspase家族参与细胞的凋亡，其中Caspase-3的激活往往启动细胞的凋亡，进一步导致细胞的死亡，因此，Caspase-3也被称作“死亡蛋白”〔15，16〕。而Caspase-6蛋白作为Caspase-3的启动因子也多见报道〔17〕。本研究说明平肝补肾药方通过抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表达，抑制细胞的凋亡。

综上，平肝补肾方通过激活ERK5信号通路，抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表达，进而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。