SRPX2和Rab31在口腔鳞癌组织中的表达、相关性及临床意义

王哲 祝率 刘欢 付蔷 胡腾龙

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，以易复发、高淋巴结转移率为特征[1]，OSCC的诊断及治疗一直是头颈肿瘤学的研究热点。目前OSCC治疗方法还是以手术治疗为主，放、化疗为辅，但各期口腔鳞癌患者术后5年生存率仅为50%～60%，几十年来未见明显改善[2]。含Sushi重复蛋白X连锁2(Sushi repeat containing protein X-linked 2，SRPX2)由Kurosawa发现于白血病细胞中，是一种分泌性蛋白质。SRPX2的突变可导致癫痫、语言认知功能障碍[3]，并与多种癌症的发生、迁徙密切相关。Ras相关蛋白31(Ras-related protein 31，Rab31)亦可称为Rab22b，RAS癌基因家族成员[4]，负责控制人类细胞蛋白和脂类的转运，也频繁参与恶性肿瘤细胞的增殖和转移。研究证实SRPX2、Rab31联合可以作为胰腺癌患者的独立预后因素[5]，但两者在OSCC中的作用却鲜有报道。本实验应用免疫组织化学染色法，检测SRPX2、Rab31在口腔鳞癌组织和正常口腔黏膜组织(Normal oral mucosal，NOM)中的表达，并进一步分析两蛋白表达与临床病理参数的关系及两蛋白之间的相关性，以期为OSCC的靶向治疗、预后评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2010年—2020年哈尔滨医科大学附属第一医院病理科的OSCC石蜡组织标本68例。所有病理切片均证实为口腔鳞癌，临床资料完整，术前均未接受放、化疗及其他辅助疗法。收集的病例中男性36例，女性32例；年龄范围为22～90岁，≥60岁患者40例，<60岁患者28例；有吸烟史患者35例，无吸烟史患者33例；根据肿瘤组织分化程度分组：高分化鳞癌40例，中低分化鳞癌28例；根据TNM分组：T1～T2期30例，T3～T4期38例。根据有无淋巴结转移分组：存在转移25例，不存在转移43例。对照组为2018年—2020年间哈尔滨医科大学附属第一医院口腔颌面外科二病房非肿瘤患者的正常口腔黏膜NOM组织，共30例。

1.2 主要试剂

兔抗人SRPX2蛋白抗体(bs-11967R)和兔抗人ras基因相关蛋白Rab31抗体(bs-19710R)购自北京博奥森生物技术有限公司。免疫组化S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法

将所有蜡块修整后，切成厚度为5 μm的切片，放入热水中烫平，贴载玻片上并烘干。常规HE染色，镜下确认病理分型。免疫组织化学SP法：将切片室温下放置60 min，二甲苯脱蜡。无水、90%、85%、75%酒精逐级降浓度入水。PBS冲洗三次，5 min/次。80%甲醛滴加后室温孵育10 min，PBS冲洗三次，5 min/次。抗原修复后PBS冲洗三次，5 min/次。滴加兔抗人SRPX2蛋白抗体一抗(1∶100)，兔抗人ras基因相关蛋白Rab31抗体一抗(1∶100)，在37℃下静置1 h。常规PBS冲洗后滴加广谱二抗，37℃下静置1 h后PBS冲洗。室温下DAB显色10 min后蒸馏水冲洗中断显色过程。复染后冲洗10 min，常规脱水、透明、封片。

1.4 结果判定

结果判定由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法进行。每张片子先于低倍镜下寻找细胞结构清晰、染色均匀的区域。转高倍镜(400×)后，于该区域随机选取5个不重叠的视野。按镜下呈现的染色强度进行评分：无阳性着色计分为0；浅黄色计分为1；棕黄色计分为2；深褐色计分为3。阳性细胞百分率评分标准为：≤10%计分为0；10%～50%计分为1；50%～80%计分为2；>80%计分为3。将两种评分的结果相乘，乘积作为切片的最终评分：乘积<3分为低表达，记为阴性(-)；乘积≥3分为高表达，记为阳性。

1.5 生物信息学分析

基于Oncomine数据库(https：//www.oncomine.org/resource/login.html)对SRPX2和Rab31进行分析，分析两者在OSCC组织和NOM组织中的表达差异。SRPX2和Rab31数据均来自Peng Head-Neck数据集，该数据集包含57例口腔鳞状细胞癌标本和22例正常口腔组织标本，共计18 148个被测基因。

1.6 随访

对实验组的68例OSCC患者进行电话随访，筛除随访时间小于6个月、随访期间接受外院其他治疗患者10人，剩余58例患者随访时间范围(8～82)个月，中位随访时间25.5个月。随访患者自确诊为OSCC开始至随访截止或因任何原因引起的死亡的时间为总生存期(OS)。

1.7 统计学分析

应用SPSS 26.0软件处理实验数据，采用χ2检验分析OSCC组织和NOM组织中SRPX2和Rab31的表达差异及两种蛋白表达与OSCC患者临床病理特征的关系。应用卡方检验计算φ系数分析OSCC中SRPX2和Rab31的相关性。应用R 4.05软件进行Wilcoxon秩和检验，分析Oncomine数据库中OSCC组织和NOM组织中SRPX2和Rab31的表达差异。采用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验进行生存分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SRPX2和Rab31在Oncomine数据库中的表达情况

基于Oncomine数据库分析发现，SRPX2和Rab31在OSCC组织中的表达高于NOM组织(P<0.05)(图1)。

图1 Oncomine数据库中口腔鳞癌和正常口腔黏膜中SRPX2和Rab31的表达

2.2 OSCC和NOM组织中SRPX2和Rab31的表达

OSCC组织和NOM组织中，SRPX2主要定位于细胞质，Rab31主要定位于细胞膜。68张OSCC组织切片中，SRPX2呈阳性表达的切片共48张，阳性表达率70.6%，Rab31呈阳性表达的切片共45张，阳性表达率66.2%；30张NOM组织切片中，SRPX2呈阳性表达的切片共10张，阳性表达率为33.3%。Rab31呈阳性表达的切片共12张，阳性表达率为40.0%。OSCC组织中SRPX2和Rab31的阳性表达率高于NOM组织，差异有统计学意义(P<0.05)(图2，表1)。

图2 SRPX2、Rab31在OSCC组织与NOM组织中的表达分布(400×)

表1 SRPX2和Rab31在OSCC组织与NOM组织中的表达

2.3 SRPX2和Rab31的表达与OSCC患者临床病理特征的关系

OSCC组织中，SRPX2和Rab31的表达与患者的性别、年龄、吸烟史、TNM分期无关(P>0.05)，与肿瘤病理分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)(表2)。

表2 68例OSCC患者中SRPX2、Rab31的表达与临床病理特征的关系

2.4 OSCC组织中SRPX2和Rab31表达的相关性

SRPX2与Rab31同时呈阳性表达的共40例，同时呈阴性表达的共15例。OSCC组织中SRPX2和Rab31的表达存在相关性(φ=0.562，P<0.001)(表3)。

表3 OSCC组织中SRPX2和Rab31表达的相关性

2.5 SRPX2、Rab31高表达组和低表达组生存曲线

SRPX2高表达的患者较SRPX2低表达的患者预后较差(χ2=7.738，P=0.005)，且Rab31高表达的患者预后同样明显较Rab31低表达的患者差(χ2=8.577，P=0.003)(图3)。

图3 SRPX2和Rab31高表达及低表达患者的生存曲线

3 讨论

OSCC靶向治疗中使用高效、敏感的治疗靶点可提高癌症患者生存率，最大限度的保留患者咀嚼、语言功能，最大程度的减轻术后牙颌面畸形的程度，从而提高患者生活质量。本研究利用Oncomine数据库对SRPX2和Rab31在OSCC组织和NOM组织中的表达进行了分析，结果发现SRPX2与Rab31在OSCC组织中的表达均高于NOM组织。通过免疫组化法，检测OSCC组织和NOM组织中SRPX2和Rab31的表达，根据实验数据进一步分析两种蛋白的表达与OSCC的关系。实验结果表明，SRPX2与Rab31在OSCC组织中呈现高表达，且两者存在相关性，在NOM组织呈现低表达或不表达，生存曲线证实SRPX2和Rab31与OSCC患者的不良预后相关，提示SRPX2和Rab31可以联合作为OSCC的靶向治疗和预后评估的指标。

SRPX2作为肿瘤治疗的新靶标已在国内外进行了广泛研究，目前多靶点治疗已经成为靶向治疗的普遍模式，我们积极寻找另一个靶点与SRPX2相匹配。Rab31一直被认为是重要的肿瘤启动因子，所以我们聚焦于Rab31，并将SRPX2和Rab31联合研究，猜想两者联合应用的广阔前景。SRPX2是一种硫酸软骨素蛋白多糖，近年来已有多位学者研究证实其在肝癌[6]、食管鳞状细胞癌[7]、非小细胞肺癌[8]等多种恶性肿瘤中呈高表达。SRPX2可以调节Wnt/β-catenin通路，增高多种恶性肿瘤对顺铂的耐药性[7]，降低肿瘤的化疗敏感性。在鳞状细胞癌组织中，SRPX2可以通过调节血管、淋巴管内皮细胞生长来促进血管、淋巴管再生[9]，为癌细胞的侵袭、转移提供途径。PI3K/AKT通过直接调节、影响细胞存活调控作用等途径抑制细胞凋亡，在肿瘤细胞中影响下游多种效应分子发挥抗凋亡作用促进肿瘤发生发展[10]。目前研究发现，下调SRPX2的表达，可以抑制前列腺癌细胞中PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并因此抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移[11]。

Rab31最先克隆于黑素细胞cDNA中[12]，在机体中参与调控囊泡运输、胞吞胞吐等生理过程，在恶性肿瘤组织中通过多种分子通路广泛参与肿瘤的发展过程[13]。Rab31过表达可促进细胞增长，抑制肿瘤细胞凋亡，激活细胞周期[14]。在乳腺癌细胞中，过表达的Rab31可以导致癌细胞由侵袭性表型向增殖性表型转变，增强细胞的增殖能力，降低黏附、侵袭能力[15]。Rab31可以通过激活PI3K/AKT信号通路提高肝癌细胞中Bcl-2/BAX等级，抑制癌细胞凋亡[16]，提示SRPX2和Rab31存在共同的信号通路，再一次佐证两者联合治疗的可行性。本次研究结果显示，SRPX2与Rab31在OSCC组织中的阳性表达率明显高于NOM组织的表达，具有统计学意义(P<0.05)。进一步研究分析发现，SRPX2和Rab31阳性表达率与OSCC患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移有关(P<0.05)。这提示我们通过检测SRPX2与Rab31的表达水平，可以做到评估OSCC的恶性等级、作为患者预后评估指标等，通过下调两者的表达来抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而抑制口腔鳞癌细胞的侵袭与转移。

尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase type plasminogen activator，uPA)和其特异性的受体纤溶酶原激活物受体(Urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)组成uPA/uPAR系统，uPA/uPAR系统可以将纤溶酶原激活为纤溶酶，而纤溶酶又裂解并激活基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)[17]。在肿瘤组织中，MMPs通过将细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)组分降解来增强肿瘤细胞迁徙、增殖的能力[18]。在OSCC的肿瘤微环境中，uPA可以影响全长和uPAR(Ⅱ～Ⅲ)的比值，潜在的影响OSCC细胞的迁移和侵袭[19]。目前研究发现SRPX2是uPAR的一种新型配体[20]，可以通过uPAR通路和整合素/FAK通路的协同作用来促进血管生成[21]。新生的血管可以为肿瘤细胞带来氧气和营养，为肿瘤细胞提供转移的途径。uPAR与活性不依赖二价离子的甘露糖6-磷酸受体(CI-M6PR)相互作用可使uPAR进入核内体降解从而调节细胞表面uPAR的水平，而Rab31则负责调节CI-M6PR从高尔基体到核内体的转运。Rab31可能通过调节CI-M6PR的转运从而控制uPAR的活性，影响肿瘤的发生和侵袭[22]。在OSCC组织中，SRPX2和Rab31可能共同参与调节uPA/uPAR系统，增强OSCC细胞侵袭和转移能力。这可能是SRPX2、Rab31和OSCC患者发生淋巴结转移相关的原因之一。

综上所述，本研究结果提示SRPX2和Rab31联合应用可以为OSCC患者治疗和预后分析提供新方向。通过对SRPX2和Rab31在OSCC中的阳性表达率以及两者的相关性进行了分析后，结合当前两种蛋白分别对uPA/uPAR系统的影响，我们虽然有理由猜测SRPX2和Rab31可能共同通过调节uPA/uPAR系统促进OSCC的转移，但仍需要进一步的研究确认两者促进OSCC发生发展、转移的具体机制。