瑞戈非尼联合哌立福辛诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制研究

陈雪健 王伟 周健 李宁 张浩鹏 徐力善

瑞戈非尼(Regorafenib)是一种新的多激酶抑制剂，用于索拉非尼治疗无效的晚期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者[1]。瑞戈非尼可作用于多个靶点来抑制肿瘤细胞增殖，例如酪氨酸激酶、血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)和成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)等[2]，这些因子参与许多细胞内的分子调节。本实验主要研究瑞戈非尼对人的肝癌细胞凋亡相关分子表达的影响，以及其联合AKT抑制剂哌立福辛(Perifosine)对肝癌细胞凋亡的作用，并且探讨瑞戈非尼导致肝癌细胞凋亡的具体机制，为药物治疗肝癌提供新的理论基础及新思路。

1 材料及方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞系HepG2购自黑龙江省分子医学生物工程研究中心。培养细胞用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养液，在5%CO2的恒温(37℃)细胞培养箱中培养。用PBS冲洗并换液，每24 h一次，用胰蛋白酶消化并传代，每1～2天一次，然后取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 药物、试剂及抗体

瑞戈非尼购自上海阿拉丁生化有限公司；AKT抑制剂哌立福辛购自美国MCE公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒购自上海东仁化学科技公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；BCA蛋白定量试剂盒购自沈阳万类生物公司；二甲基亚砜、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、胎牛血清、胰酶细胞消化液购自上海碧云天公司；双色预染蛋白Marker、ECL试剂盒、细胞裂解液购自上海雅酶生物科技有限公司；一抗β-actin、p-AKT、AKT、p21、p27、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9购自美国CST公司。

1.3 CCK-8检测细胞存活率

用含有血清的培养液将HepG2细胞稀释后，接种至96孔板，每孔2 000个细胞，将96孔板放入培养箱(5%CO2，37℃)中，等待细胞贴壁后，将瑞戈非尼按照浓度梯度(0、1、5、10、15、20、25 μmol/L)依次加入96孔板中，其中0 μmol/L为对照组，每组中5个平行样孔。培养48 h，然后将每孔的培养液吸出，加入CCK-8试剂，再次在培养箱中培养2 h，取出后在450 nm波长的酶标仪中测OD值。

1.4 细胞凋亡检测

采用对数生长期的HepG2细胞系，将其接种在培养瓶中，待细胞贴壁，PBS冲洗、换液，设置两组实验条件，分别是0、5、10、20 μmol/L的瑞戈非尼单独处理肝癌细胞和0、10 μmol/L的哌立福辛、20 μmol/L的瑞戈非尼及双药联合(10 μmol/L的哌立福辛联合20 μmol/L的瑞戈非尼)处理肝癌细胞。恒温条件下培养48 h，把培养液倒入离心管中，接下来将胰蛋白酶(不含EDTA)消化下来的细胞也加入离心管中，离心机(1 000 r/min，5 min)离心后，弃上清液，PBS重悬，显微镜下细胞计数，再次离心后弃掉上清液，离心管中加入蛋白缓冲液稀释，细胞浓度为每毫升1×106个，抽取离心管中的细胞悬液100 μL，加入5 mL流式管中，根据说明，Annexin Ⅴ-FITC及PI各5 μL加入流式管中，充分混匀，室温下完全避光静置，15 min后，400 μL的蛋白缓冲液加入各个流式管中，1 h内完成凋亡检测。

1.5 Western blot检测相关凋亡蛋白的表达情况

设置两组实验条件，分别是0、5、10、20 μmol/L的瑞戈非尼单独处理肝癌细胞和0、10 μmol/L的哌立福辛、20 μmol/L的瑞戈非尼及双药联合(10 μmol/L的哌立福辛联合20 μmol/L的瑞戈非尼)处理肝癌细胞。培养48 h后，收集对数生长期的细胞，放于冰块中操作，PBS冲洗后，离心机(1 000 r/min，5 min)离心，而后弃掉上清，重复2～3次上述操作，加入裂解液裂解细胞，离心后，留取上清液，BCA试剂盒来配置显色液，酶标仪测蛋白浓度，最后蛋白样品放入沸水中，5 min后取出，-80℃保存。蛋白(30～40 μg)上样至各孔，先调节电压80 V，开始电泳，等待Maker进入下层胶分离后，电压改为120 V。电泳结束后，进行转膜(电流为300 mA)，蛋白质分子量的大小决定转膜时间的长短，转膜后将PVDF膜放入封闭液中，室温下封闭1～2 h，再用TBST洗膜1次，加入抗体β-actin、p-AKT、AKT、p21、p27、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9，一抗浓度为1∶1 000，在冰箱(4℃)中孵育过夜。然后洗膜3次，加入二抗(1∶2 000)，室温下孵育2 h，再洗膜3次，最后在分子成像仪ChemiDocTMXRS+成像系统下显影分析。图像通过Image LabTM软件进行量化，β-actin作为内参，所有实验重复三次。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 瑞戈非尼对肝癌细胞增殖的抑制作用

本实验通过设置不同的瑞戈非尼药物浓度梯度(1、5、10、15、20、25 μmol/L)来验证其对细胞增长的抑制能力，用CCK-8法检测肝癌细胞的存活率，在2 h时研究发现，从瑞戈非尼浓度为5 μmol/L起，随着瑞戈非尼药物浓度增加，肝癌细胞存活率明显降低(P<0.05)，IC50为18.45 μmol/L(图1)。

图1 CCK-8检测不同浓度瑞戈非尼处理肝癌细胞后的细胞存活率

2.2 瑞戈非尼对肝癌细胞凋亡的促进作用

设置不同浓度的瑞戈非尼(0、5、10、20 μmol/L)处理HepG2细胞48 h后，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，研究发现，随着瑞戈非尼的浓度增加，细胞凋亡率也显著上升，与对照组相比，瑞戈非尼浓度为5、10、20 μmol/L时的凋亡率从6.89±2.74%分别上升至17.77±4.47%(P<0.05)，37.59±6.87%(P<0.01)及55.14±8.31%(P<0.01)(图2)。所以瑞戈非尼可促进HepG2细胞系的细胞凋亡。

图2 不同浓度瑞戈非尼处理肝癌细胞后的细胞凋亡的情况

2.3 瑞戈非尼对凋亡相关蛋白表达的影响

为了进一步研究瑞戈非尼在促进肝癌细胞凋亡方面的分子机制，本研究采用不同浓度的瑞戈非尼处理肝癌细胞48 h后，应用Western blot方法检测相关蛋白表达变化。研究发现，与对照组相比，随着瑞戈非尼浓度的增加，p21、p27、Bax、Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9的蛋白表达量明显增高(P<0.05)，而Bcl-2、p-AKT的蛋白表达量降低(P<0.05)(图3)。

图3 Western blot检测相关蛋白表达情况

2.4 瑞戈非尼与哌立福辛联合应用对细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响

本研究用哌立福辛、瑞戈非尼及瑞戈非尼联合哌立福辛处理肝癌细胞，处理48 h。流式细胞仪分析细胞凋亡率情况：双药联合组的凋亡率(58.05±4.89)%明显高于哌立福辛组凋亡率(14.07±2.84)%(P<0.01)及瑞戈非尼组凋亡率(29.68±3.07)%(P<0.05)(图4A，图4B)。用Western blot分析凋亡相关蛋白表达情况，研究发现，与对照组(P<0.01)、哌立福辛组(P<0.05)和瑞戈非尼组(P<0.05)比较，双药联合组Bcl-2、P-AKT表达量下降以及Bax表达量增加(图4C，图4D)。结果表明瑞戈非尼联合AKT抑制剂哌立福辛对肝癌细胞凋亡的作用比单药更加显著。

图4 瑞戈非尼与哌立福辛联合应用后对肝癌细胞的影响

3 讨论

肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，其在男性中居第5位，在女性中居第7位，全球内的肝癌发病率有逐年升高趋势[3]。导致肝癌的危险因素有许多，其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染占54%，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染占31%，其它因素包括饮酒、代谢等[4]。根治性手术切除肿瘤或者肝移植可能治愈肝癌[5]，但是对于晚期肝癌患者几乎无法进行外科治疗。研究发现索拉非尼作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可以抑制肿瘤的血管生成及抑制肿瘤的增殖[6]。索拉非尼在2007年被批准用于肝癌[7]，对于应用索拉非尼治疗后仍进展的肝癌，可应用瑞戈非尼。瑞戈非尼是第一种被批准的用于肝癌的二线药物。瑞戈非尼是比索拉非尼抑制范围更广泛的酪氨酸激酶，并且抑制作用更强[8]。

p21、p27作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要的成员[9]，当p21或p27接受到由细胞内、外产生的刺激时，其表达上调，来确保细胞适当的有丝分裂，及时使细胞周期停滞，起到抑癌作用，相反，其低表达时起到致癌基因的功能[10-11]。AKT又被称为蛋白激酶B，其在调节细胞代谢、周期、增殖等方面起着重要作用[12]，AKT的异常与肿瘤发生、代谢性疾病、神经系统疾病及心血管疾病等都有一定程度关系[13]。本研究结果显示，肝癌细胞经过瑞戈非尼处理后，p21、p27表达增加，p-AKT表达减少，表明肿瘤细胞增殖受到抑制。

细胞凋亡的调控与Bcl-2蛋白家族有极大的相关性[14]，Bcl-2蛋白家族分为两类：促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白。Bcl-2蛋白是其中一种抗凋亡蛋白，与许多肿瘤的发生有关[15-16]。Bax与Bcl-2为互相拮抗的关系，Bax通过与Bcl-2结合为二聚体来调节Bcl-2[17]。Caspase家族与细胞的凋亡息息相关[18-19]，其中Caspase-8、Caspase-9参与细胞凋亡的起始步骤，然后其将凋亡信号向下传导直至执行凋亡程序[20]。因此本研究选取相关的蛋白检测其表达水平，结果发现，随着药物浓度的增加，Bax表达水平增高，Bcl-2表达水平降低，Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-9等蛋白表达增加，实验结果表明瑞戈非尼能够诱导肝癌细胞凋亡相关蛋白表达变化，导致肝癌细胞发生凋亡。并且，本研究的实验结果表明，同时加入哌立福辛后，双药联合组对Bax、Bcl-2及p-AKT表达的影响程度明显大于哌立福辛组和瑞戈非尼组，因此可以认为瑞戈非尼与哌立福辛联合应用促进肝癌细胞凋亡效果更显著。

综上所述，瑞戈非尼通过上调p21、p27、Bax、Caspase-8、Caspase-9，下调Bcl-2、p-AKT诱导肝癌细胞凋亡，并且瑞戈非尼与哌立福辛联合应用促进肝癌细胞凋亡效果更显著，为药物治疗肝癌提供了新的理论基础及思路，对于今后临床治疗肝癌起到了积极作用。