以海藻为原料的乙醇发酵过程中关键酶研究

＊张雯 裘雨妮 周家杰

（浙江树人大学生物与环境工程学院 浙江 310015）

1.引言

随着人口的快速增长和世界经济的不断发展，全球化石燃料消耗量逐年增加，石油资源储备已经到了濒临枯竭的地步。面对煤、石油、天然气等不可再生能源的枯竭，以及化石燃料的燃烧，二氧化碳不断地排放致使全球变暖，给我们的环境带来威胁，寻找新能源替代已经成为必须解决的问题。可再生燃料生物乙醇，被认为是一种能有效替代化石燃料的理想新能源[1-2]。生物乙醇作为能够循环利用的能源，对于未来能源结构、能源安全的提升具有重要的战略意义。进入2l世纪，我国经济和社会可持续发展面临的许多种不同的问题越来越突出，开发生物乙醇作为化石能源的替代品，节省消耗，这种战略举措是我国解决能源问题的重要措施。乙醇燃料具有燃烧更彻底、CO2排放较低、燃烧性能较好等优良特性，成为21世纪的“绿色能源”。世界各国正加快生物乙醇研究开发与推广应用的步伐[3-4]。

目前玉米、甘蔗等农作物是用来提取生物质乙醇的重要原料，生物燃料在很大程度上是地上作物，而全球农业产品价格可能会上涨，仅靠这种途径难以实现新能源的替代，必须开发更多的可持续的生物质能源原料，许多研究人员正在寻找替代生物质资源生产生物乙醇[5]。藻类生物乙醇被认为是下一代生物燃料来源。海藻是能够进行光合作用的海洋生物，它们将阳光、水和二氧化碳转变成为藻类的生物需要，这使许多藻类富含碳水化合物，而碳水化合物是生产生物能源的基本原料。海洋藻类资源是很丰富的，海洋占地球面积约70%，占到整个生态系统的90%，海洋中的藻类为生物产业能够工业化生产提供了取之不尽用之不竭的资源来源。大型海藻如海带仅需要光照和一些简单的营养物质就能在海水中很好的生长；大型海藻作为替代性再生能源的发展潜力巨大[6]。但是大型海藻如褐藻中的主要成分海藻酸难以降解，使得褐藻的乙醇转化效率较低。

我国另外一些主要的经济藻类如马尾藻，因其海藻酸含量为30%，故广泛应用于海藻酸的工业生产中。海藻酸的降解是海藻乙醇生产面临的主要技术问题及瓶颈[7]。在前期研究中，课题组通过筛选获得了能降解海藻酸的酵母菌[8]，在本研究中，利用该种酵母菌进行海藻乙醇发酵，并针对海藻的乙醇发酵过程中关键酶进行研究，以为海藻的乙醇发酵生产提供理论依据。

2.实验材料与方法

（1）实验材料：野生海藻。

（2）菌株来源：实验室筛选获得酵母菌[8]。

（3）培养基：

活化斜面培养基：蛋白胨2%，酵母粉1%，海藻酸钠2%，琼脂2%。

YPD液体培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。

驯化培养基：硫酸铵10.8g/L，磷酸二氢钾5.0g/L，硫酸镁1.1g/L，海藻酸钠20g/L。

海藻发酵液培养基：硫酸铵10.8g/L，磷酸二氢钾5.0g/L，硫酸镁1.1g/L，海藻20g/L。

（4）海藻发酵实验：首先对保存菌株进行活化，并用YPD液体培养基进行扩大培养，以10%的接种量转接到驯化培养基中，进行两轮驯化培养，每轮驯化培养的时间为48h。然后以10%的接种量接种到海藻发酵培养基中，因发酵为厌氧发酵，故在接入种子后的第二天用保鲜膜密封瓶口。

（5）酶活力检测方法：

①丙酮酸脱羧酶酶活检测

取发酵液上清液30mL，在3500rpm下离心20min，用10mmol/L磷酸钠且含有2mmol EDTA的缓冲液洗2次，取沉淀，用EDTA-磷酸钠缓冲液冲洗沉淀，使其重悬，在3500rpm下离心20min，离心后用适量的100mmol磷酸钠且含2mmol MgC12的缓冲液重悬，进行超声波破碎，全程时间为10min，超声时间是1s，间隔时间是1s，温度25℃，离心，取上清液即可用于丙酮酸脱羧酶活性的测定。分别吸取2.7mL 200mmol/L柠檬酸缓冲液，0.1mL 1moL/L丙酮酸钠溶液，0.1mL 6.4mmol/L β-NADH于比色皿中（因发酵液中发酵菌株内已有乙醇脱氢酶且含量高于实验要求故实验中无需加入乙醇脱氢酶）。在空白对照的比色皿中加入2.8mL 200mmol/L柠檬酸缓冲液和0.1mL 1mol/L丙酮酸钠溶液，同时两者都加入0.1mL细胞抽提物，迅速混合均匀，在340nm波长下进行变化，每15s记录一个数据，待吸光度值趋于稳定时，记下吸光度值的减少量以及这个过程所用的时间，得到每分钟减少的吸光度值，然后计算出比酶活。

②乙醇脱氢酶的酶活检测

取发酵液上清液40mL，离心（4000rpm/min，20min），沉淀用0.066mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤2～3次。加入含有5% 50mmol/L的Tris-HCl（pH值8.0）、0.2% 1mmol/L的EDTA、2% 100mmol/L的NaCl缓冲溶液，用超声波破碎法进行细胞破碎，每超声1s间歇3s，320W作用15min。4000rpm/min离心15min，取上清液，4℃保藏为粗酶液。于石英比色皿中加入3mL 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液、0.4mL 0.05mol/L的NAD+溶液、0.4mL 17mol/L的乙醇溶液，混匀，再加入0.2mL粗酶液，快速混匀后立即在340nm处测定吸光度值，空白对照用蒸馏水代替加NAD+，其余均相同，每隔30s读一次吸光度值，进行酶活的计算。

③海藻酸裂解酶的酶活检测

取发酵液上清液，4000rpm离心15min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，即粗酶液，4℃保存。取0.5mL粗酶液加入到盛有0.5mL 0.5%海藻酸钠底物（将海藻酸钠溶于0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液中，pH7.5）的试管中，混匀，于40℃水浴反应10min，对照组中的酶液用去离子水代替。还原糖的测定采用DNS（3.5-硝基水杨酸）法。在1mL反应液中加入1mL DNS溶液，沸水浴反应5min后，流水冷却，定容至25mL。以蒸馏水为空白，应用分光光度计在520nm下测定吸光度。与标准曲线相比较，计算还原糖的产生量。酶活力单位定义为：酶液在上述条件下，每分钟产生1μg还原糖所需要的酶量。

3.结果与讨论

(1)丙酮酸脱羧酶研究

首先对发酵液进行一定的预处理，得到含有丙酮酸脱羧酶的粗酶液，分别吸取2.7mL 200mmol/L柠檬酸缓冲液，0.1mL 1moL/L丙酮酸钠溶液，0.1mL 6.4mmol/L β-NADH，0.05mL 200U/L乙醇脱氢酶溶液于比色皿中。在空白对照的比色皿中加入2.8mL 200mmol/L柠檬酸缓冲液和0.1mL 1mol/L丙酮酸钠溶液，同时两者都加入0.1moL细胞抽提物，迅速混合均匀，在340nm波长下测定，每15s记录一个数据，记录7min共28个数据，从而计算出吸光度。待吸光度值稳定后，记录从开始到稳定时吸光度的变化数值和在变化过程中所用去的时间，得到每分钟吸光度的减少值。对数据进行分析，根据对在发酵过程中3（0.400U/mL）、4（1.000U/mL）、5（1.500U/mL）、6（1.900U/mL）、7（1.200U/mL）天的发酵液进行丙酮酸脱羧酶活性的测定数据，画出丙酮酸脱羧酶在发酵过程中含量的变化趋势图如图1。

图1 丙酮酸脱羧酶活性变化趋势

分析：

由丙酮酸脱羧酶活性变化趋势图可以看出在发酵开始时丙酮酸脱羧酶活性逐渐升高，当在第6天时酶活力值最高，最高为1.900U/mL，在达到最高值后第7天酶活力降低。丙酮酸脱羧酶是控制丙酮酸进一步代谢的主要依赖酶，其活性成为能否积累丙酮酸的关键之一，据此推测第6天时发酵液中丙酮酸的含量开始下降，此推断很好的契合了发酵液中丙酮酸含量的变化。

(2)海藻酸裂解酶研究

①海藻酸裂解酶活性测定

对发酵液在3天、4天、5天、6天、7天分别进行海藻酸裂解酶活性的研究，首先进行粗酶液的制取，分别取不同天的粗酶液0.5mL加入到盛有0.5mL 0.5%海藻酸钠底物（将海藻酸钠溶于0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液中，pH7.5）的试管中，混匀，于40℃水裕中反应10min，对照组中的酶液用去离子水代替。以反应液中还原糖的增加量作为检测活力的指标，对于还原糖的增加量应用DNS法进行测量，根据还原糖标准曲线y=1.3627x+0.0167得出还原糖的含量，根据酶活定义：酶液在上述条件下，每分钟产生1μg（1μg=0.000001g）还原糖所需要的酶量可以计算出酶活。

根据对在发酵过程中3天（18.4U/mL）、4天（37.3U/mL）、5天（48.4U/mL）、6天（41.6U/mL）、7天（29.8U/mL）的发酵液进行海藻酸裂解酶活性的测定数据，画出海藻酸裂解酶在发酵过程中含量的变化趋势图如图2。

图2 海藻酸裂解酶活性变化趋势

分析：

由上表可知在整个发酵过程中发酵液当中海藻酸裂解酶活性不是太高，其原因可能是提取的粗酶液仅仅是产生在胞外的一部分酶，而且由于时间限制，没有进行纯化，故酶活力较低，由趋势图可以看出海藻酸裂解酶在开始发酵时（3天时）酶活不是很高，而在发酵4-5天时酶活明显升高，第5天时达到最高为48.4U/mL，此时发酵液当中海藻酸裂解旺盛，用于乙醇生产的糖供应丰富，在6-7天时酶活降低表明海藻酸裂解减少，菌的活性降低，菌开始死亡。

②判定EDTA对酶活力的影响

分别测定添加EDTA（乙二胺四乙酸）和未添加EDTA的海藻酸裂解酶粗酶液反应体系的吸光度值：做三个平行试验，用同批发酵的三瓶相同发酵液分别提取粗酶进行测定，结果表明：添加EDTA的酶液活力明显低于未添加EDTA的酶液，证明EDTA能够减弱海藻酸裂解酶的活性，但是并没有使海藻酸裂解酶完全失活，推测可能是由于EDTA的添加量不够，或是其未全部溶于溶液中，因为EDTA不溶于水，需调pH至7.5才能将其溶解。

(3)乙醇脱氢酶研究

对发酵液进行乙醇脱氢酶活性变化的研究，乙醇脱氢酶是胞内酶，因此需要破碎细胞提取酶，但是由于时间和技术限制，无法对其进行纯化，故粗酶液活力较低。通过计算可知5天发酵液的粗酶液酶活力125U/mL粗酶液。同理，在发酵3天、4天、6天及7天也进行了酶活力测定，分别为71.1U/mL，94.8U/mL，111.4U/mL和97.2U/mL。绘制酶活力变化趋势图，如图3。

图3 乙醇脱氢酶活性变化趋势

分析：

由表可以看出乙醇脱氢酶在发酵开始时（发酵第3天时）酶活很小，而在发酵第4、5天时酶活迅速上升，同时此时也是产生乙醇的重要时间，6天后酶活开始降低，此时海藻酸裂解变少，乙醇产生量降低，菌体开始进入死亡状态。

4.结论

对发酵过程中三种关键酶的研究中，在发酵开始时丙酮酸脱羧酶活性逐渐升高，在第6天时酶活力值最高，最高为1.9U/mL，第7天酶活力降低。丙酮酸脱羧酶是控制丙酮酸进一步代谢的主要依赖酶，此数据很好的契合了发酵液中丙酮酸含量的变化；可以看出海藻酸裂解酶在开始发酵时（3天时）酶活不是很高，而在发酵4-5天时酶活明显升高，第5天时达到最高为48.4U/mL，此时发酵液当中海藻酸裂解旺盛，用于乙醇生产的糖供应丰富，在6-7天时酶活降低表明海藻酸裂解减少，菌的活性降低，菌开始死亡，而EDTA对于海藻酸裂解酶的活性具有一定的抑制作用，会降低酶活；乙醇脱氢酶在发酵开始时（发酵第3天时）酶活很小，在发酵第4、5天时酶活迅速上升，第5天时酶活达到最高为125U/mL同时也是产生乙醇的重要时间，6天后酶活开始降低，此时海藻酸裂解变少，乙醇产生量降低，菌体开始进入死亡状态。