黄芩苷对泛发性脓疱型银屑病患者机体Th1/Th2失衡及T-bet/GAGA-3表达的影响▲

肖 敏 徐洪来 吴栋杰 覃卫华 由长辉

(柳州市人民医院1 皮肤科，2 肝胆外科，广西柳州市 545006，电子邮箱：xuhonglai1973@163.com)

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病，难以根治，严重影响患者的生活质量。全世界约有1.25亿人患银屑病[1]，在中国银屑病的发病率约为0.1%～3.0%[2]。泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)是罕见且严重的银屑病类型，该病起病突然，发展迅速，可导致继发感染或心肺衰竭，甚至死亡[3]。因GPP的发病机制尚不清楚，所以治疗难度大。目前，系统性药物是治疗GPP不可缺少的一部分。维A酸、免疫抑制剂和糖皮质激素常用于治疗GPP，但可导致肺纤维化、呼吸功能衰竭、肝肾功能受损和继发感染等严重并发症[3]。生物制剂是治疗GPP的新兴方法，但价格昂贵，也容易导致中枢神经系统感染、上呼吸道感染、高血压、炎症性肠病和肿瘤等不良反应，因此其长期安全性仍有待于进一步的临床观察[4]。此外，上述治疗药物只能获得近期疗效，不能防止GPP复发[5]。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取出的一种黄酮类化合物。既往研究显示，使用黄芩苷有助于寻常型银屑病皮损的消退，但其具体作用机制尚不清楚[6]。本研究探讨黄芩苷对GPP患者机体Th1/Th2失衡及T盒子转录因子(T-box transcription factor，T-bet)/GATA 结合蛋白 3(GATA binding protein 3，GAGA-3)表达的影响，并分析其可能机制，为临床治疗GPP提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2月至2019年11月在柳州市人民医院皮肤科就诊的36例GPP患者，所有患者皮损总面积均超过60%，表现为全身弥漫性红斑、浅在淡黄色无菌性小脓疱及脓湖。排除标准: (1)严重脑、心、肺、肝、肾损害者；(2)严重感染、免疫抑制和肿瘤患者；(3)妊娠期及哺乳期妇女；(4)近1个月内接受过维A 酸类药物、免疫抑制剂、全身糖皮质激素及生物制剂等治疗的患者；(5)皮损处局部用药者。其中男性19例、女性17例；年龄20～55(38.36±8.92)岁；入院体温 37.5℃～39.9℃(38.83±0.53) ℃。本研究经医院医学伦理委员会审查批准，所有患者对本研究知情且已签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器 淋巴细胞分离液LymphoprepTM(挪威Axis-Shield公司，批号：1114546)；TRIzol试剂(美国Invitrogen公司，批号：5346994)，细胞固定液/细胞破膜液(美国Invitrogen公司，批号：HH-V13241)；RPMI 1640培养基(美国HyClone公司，批号：SH30809.01B)，胎牛血清(美国HyClone公司，批号：021-60348065)，胰蛋白酶(美国HyClone公司，批号：SV30031)，青霉素及链霉素溶液(美国HyClone公司，批号：SV30010)，无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS；浙江联硕生物科技有限公司,货号：K812-20L)；黄芩苷(南京源植生物科技有限公司，批号: 21967-41-9)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司，货号：G4101-1000T)；人白细胞介素 (interleukin,IL)-2(英国Abcam公司，批号：ab62926)，IL-4(英国Abcam公司，批号：ab215089)，IL-5(英国Abcam公司，批号：ab46026)，IL-6(英国Abcam公司，批号：ab246838)，IL-10(英国Abcam公司，批号：ab185986)，IL-13(英国Abcam公司，批号：ab272466)，γ-干扰素(英国Abcam公司，批号：ab224197)和肿瘤坏死因子β(tumor necrosis factor β,TNF-β;英国Abcam公司，批号：ab229202)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒；实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号：DRR420A)；上下游引物均由上海生工生物工程有限公司合成；藻红蛋白抗人IL-4(美国eBioscience公司，批号：20191020)及藻红蛋白抗人γ-干扰素(美国eBioscience公司，批号：20191205)。超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1FD/2F)；多功能酶标仪(美国Thermo公司，型号: Varioskan LUX )、CO2培养箱(美国Thermo公司，型号: HERAcell 240i )；流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCanto Ⅱ)；荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司，型号：LightCycler 96)。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血单个核细胞分离：抽取GPP患者晨起空腹肘静脉血10 mL，放置于肝素钠抗凝管中，1 000 r/min离心10 min，分离血浆，根据Ficoll密度梯度离心法[7]，用淋巴细胞分离液LymphoprepTM分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。将PBMC放置于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640完全培养基中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。每隔1 d更换1次培养基，胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT法检测黄芩苷对PBMC活力的影响：将PBMC接种于含有RPMI 1640完全培养基的96孔培养板中，接种密度为1×104个/孔，分为6组进行实验，每组设6个平行孔，继续置入37℃、5%CO2培养箱中培养24 h；待PBMC贴壁后，弃去培养基，每孔分别加入含0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL黄芩苷的RPMI 1640培养基100 μL，以0 μg/mL黄芩苷组培养的细胞作为阴性对照组，其余均为实验组，继续在37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后终止培养，弃去孔内液体，更换不含黄芩苷的新鲜无血清RPMI 1640培养基，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h。吸除孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min使结晶充分溶解，采用酶标仪于570 nm波长下测定各孔光密度值，并计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。选出最适宜的黄芩苷无毒研究浓度。

1.3.3 黄芩苷处理PBMC：随机抽样法选取6例GPP患者的PBMC，加入最适宜浓度黄芩苷处理细胞，以0 μg/mL黄芩苷培养基培养的细胞为阴性对照组，培养48 h，方法同1.3.2。

1.3.4 流式细胞术检测Th1和Th2细胞比例：将1.3.3中的PBMC经0.25%胰酶消化，PBS洗涤1 min后，3 000 r/min离心细胞30 s，弃上清液，再按上述方法洗涤离心细胞1次，弃上清液，再用PBS重悬细胞后，加入异硫氰酸荧光素抗CD4抗体(美国eBioscience公司，批号：20190515)进行表面染色，室温避光孵育15 min后按操作要求加入固定液和破膜液，随后加入藻红蛋白抗人IL-4及藻红蛋白抗人γ-干扰素，4℃孵育30 min，PBS洗涤2 次，1 min /次。使用流式细胞仪检测Th1和Th2比例。

1.3.5 ELISA法检测Th1和Th2细胞因子表达水平：取1.3.3的两组PBMC，根据ELISA试剂盒说明书分别检测细胞培养上清液中Th1分泌因子(IL-2、γ-干扰素、TNF-β)和Th2分泌因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13)的表达水平。

1.3.6 实时荧光定量PCR法检测PBMC中T-bet、GATA-3 的mRNA表达水平：收集1.3.3的两组PBMC，利用TRizol法提取PBMC的总RNA，反转录合成cDNA(反转录试剂盒购自美国默飞世尔生物科技有限公司，批号：K1622)。利用实时荧光定量PCR检测试剂盒检测T-bet和GATA-3的mRNA表达情况。T-bet上游引物序列为5′-GTTCCCATTCCTGTCATTTACT-3′，下游引物序列为5′-TCTCCGTCGTTCACCTCAA-3′；GATA-3上游引物序列为5′-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3′，下游引物序列为5′-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3′。以β-肌动蛋白作为内参，β-肌动蛋白上游引物序列为5′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物序列为5′-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3′。反应体系：10×Buffer 20 μL,dNTP 16 μL，上游引物6 μL，下游引物6 μL，Taq-酶10 μL，DdH2O 140 μL，模板DNA 2 μL。反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。根据2-ΔΔCt计算T-bet和GATA-3 的mRNA相对表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芩苷对GPP患者PBMC活力的影响 不同浓度黄芩苷组PBMC存活率差异有统计学意义(P<0.05)。300 μg/mL 、400 μg/mL黄芩苷组PBMC存活率均低于其他组，且400 μg/mL黄芩苷组PBMC存活率低于300 μg/mL组(均P<0.05)，见表1。因此选择200 μg/mL作为最适宜的无毒研究浓度。

表1 不同浓度黄芩苷组PBMC存活率的比较(x±s，%)

2.2 两组PBMC中Th1、Th2比例及其分泌的细胞因子水平的比较 与阴性对照组比较，200 μg/mL黄芩苷组的 Th1比例及其分泌的IL-2、γ-干扰素、TNF-β表达水平降低，而Th2比例及其分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13表达水平升高(均P<0.05)，见表2。

表2 两组PBMC中Th1、Th2比例及其分泌的细胞因子水平的比较(x±s)

2.3 两组PBMC中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA相对表达水平的比较 200 μg/mL黄芩苷组PBMC细胞T-bet mRNA相对表达水平低于阴性对照组，GATA-3 mRNA相对表达水平高于阴性对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组PBMC中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

银屑病可分为寻常型、关节病型、脓疱型和红皮病型，其中脓疱型银屑病约占所有银屑病类型的1.0%[8]。脓疱型银屑病又可分为GPP和局限性脓疱型银屑病。GPP是银屑病中最严重的类型[9]。该病是在无皮损的正常皮肤上或寻常型银屑病红斑、丘疹、斑块、鳞屑等皮损的基础上，迅速出现针尖至粟粒大小的淡黄色无菌性小脓疱，分布密集，可融合成片状脓湖，并快速发展至全身，患者常伴有寒战、高热、白细胞增多和低蛋白血症等临床表现。GPP还可并发银屑病性关节炎，并与高血压、糖尿病、高胆固醇血症、代谢综合征和肥胖等密切相关[10]。GPP的治疗至今仍非常棘手，故寻找安全有效的GPP治疗药物是当前研究的热点[5]。

GPP以角质形成细胞过度增殖为病理特点，皮损部位存在大量激活的T淋巴细胞，激活的T淋巴细胞可促进角质形成细胞过度增殖和分化[11]。T淋巴细胞根据表面分化抗原的不同，可分为CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞，简称CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。CD4+T淋巴细胞主要由Th构成，初始 CD4+T淋巴细胞接受抗原刺激的信号，在不同的条件下可分化成不同的T淋巴细胞亚群，根据分泌的细胞因子不同，可分为Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和调节性T细胞[12]。这些细胞各自具有不同的生物学功能。Th1可分泌IL-2、γ-干扰素、TNF-β等细胞因子，主要促进细胞免疫应答，表现为：增强吞噬细胞的吞噬和处理抗原功能，参与细胞毒作用和迟发型超敏反应性炎症，IL-2可促进细胞毒性T细胞的活化。Th1的持续性强应答参与特异性自身免疫性疾病、不明原因的慢性炎症性疾病、接触性皮炎、迟发型超敏反应性疾病、急性同种异体移植排斥反应等的发生和发展[13]。Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等细胞因子，主要促进体液免疫应答，表现为：诱导B淋巴细胞分化为浆细胞产生抗体，趋化B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，其中IL-4能促使B淋巴细胞所合成的抗体向IgE和IgG1转换。Th1和Th2之间存在互相制约和调节的复杂关系：Th1所分泌的γ-干扰素可抑制Th2增殖和分化，而Th2所分泌的IL-4和IL-13可共同抑制Th1的功能和分化，且Th2所分泌的IL-10可明显抑制Th1分泌细胞因子，并间接促进Th2分化[14]。微环境中细胞因子调控的Th1和Th2分化具有重要临床意义。正常机体内，Th1和Th2维持着动态平衡。银屑病患者Th1功能增强，而Th2功能受到抑制，因此体内常检测到大量Th1存在，并高表达Th1相关细胞因子，导致Th1和Th2出现严重失衡(又称偏移)[15]。因此，通过改变局部微环境中细胞因子的组成，即将细胞因子微环境中的Th1向Th2推动，可能成为对银屑病进行干预的有效手段[16]。

多种转录因子调控着Th1、Th2的分化，其中以T-bet和GATA-3最为重要[17]。T-bet又称为TBX21，位于人基因的17号染色体上，于2000年被发现，属于T-box家族新成员[18]。T-bet选择性地表达于Th1，通过激活信号转导和转录激活子1通路，促进Th0向Th1分化。T-bet基因和γ-干扰素之间有高度的相关性：T-bet基因可转录激活γ-干扰素基因，诱导内源性γ-干扰素的生成和γ-干扰素等位基因的染色体重排，促进γ-干扰素的表达上调；而γ-干扰素可正反馈调节T-bet的表达水平，形成一个自分泌反馈环[19]。T-bet能够抑制Th1向Th2分化，并抑制Th2相关细胞因子的合成，达到抑制Th2分泌IL-4的效果，因此，T-bet被认为是Th1定向分化的标志性基因[20]。GATA-3属于GATA转录因子家族，是近年来发现的一种重要的锌指蛋白。GATA-3在Th0中呈低表达，其作用与T-bet相反，对Th1分化成熟有抑制作用，并抑制γ-干扰素的表达；同时，γ-干扰素的生成减少也降低了GATA-3的水平[21]。GATA-3能够推动Th0向Th2分化，抑制T-bet的表达从而抑制Th1反应，促进Th2反应，诱导分泌Th2 相关细胞因子。GATA-3的表达上调可能是通过IL-4/信号转导和转录激活子6通路实现，IL-4、IL-5和IL-13的基因启动子区域均包含GATA-3的结合位点。因此，GATA-3在Th2极化过程中起着关键作用[22]。总之，Th0向Th1分化时，T-bet表达上调，GATA-3表达下降；Th0向Th2分化时，GATA-3表达上调，T-bet表达下降[23]。由此可见，T-bet/GATA-3可作为准确反映Th1/Th2失衡与漂移的指标。

黄芩的功效为清热除湿、泻火解毒，毒性低、副作用小且价格低廉。黄芩苷是黄芩中最有效的化学成分之一。黄芩苷具有降压、抗变态反应、抑菌、抗炎、抗肿瘤等药理作用，可用于心血管疾病、脑缺血、肝炎、肺炎、感染和肿瘤等疾病的治疗[24]。随着对黄芩苷分子机制的深入研究，有学者发现黄芩苷可参与细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应等过程，并通过调节炎症信号通路抑制多种炎症因子的表达，是一种应用前景较好的抗炎药物[25]。近年来有研究显示，黄芩苷能抑制角质形成细胞的活力，对银屑病具有较好的治疗效果[6]。但黄芩苷治疗脓疱型银屑病的作用机制，目前尚不清楚。

本研究结果显示，与阴性对照组比较，200 μg/mL黄芩苷组的 Th1细胞比例及IL-2、IFN-γ、TNF-β表达水平降低，而Th2细胞比例及IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13表达水平升高(P<0.05)，说明黄芩苷对GPP患者体内Th1/Th2的免疫失衡具有调节作用，能下调Th1水平，抑制Th1相关细胞因子的表达，同时上调Th2水平，促进Th2相关细胞因子的表达，能够促进过度反应的 Th1向Th2漂移，达到两者间的平衡。此外，200 μg/mL黄芩苷组PBMC中T-bet mRNA相对表达水平低于阴性对照组，GATA-3 mRNA相对表达水平高于阴性对照组(P<0.05)，表明黄芩苷能抑制GPP患者PBMC中Th1转录因子T-bet mRNA的表达，并促进Th2转录因子GATA-3 mRNA的表达。这也侧面反映了T-bet 参与了Th1的分化过程，促进了Th0向Th1分化；GATA-3参与了Th2的分化过程，促进了Th0向Th2分化。

综上所述，黄芩苷能抑制Th1相关转录因子T-bet的表达，下调Th1细胞水平，并增强Th2相关转录因子GATA-3的表达，上调Th2细胞水平，从而促进Th1细胞向Th2漂移，调节Th1/Th2的失衡。