酶辅助高效提取龙虾壳中甲壳蛋白的工艺研究

贾存江，王英燕

(1 江苏天士力帝益药业有限公司，江苏 淮安 223003；2 江苏神华药业有限公司，江苏 淮安 211600)

龙虾学名Palinuridae，属于节肢动物门软甲纲十足目龙虾科[1]。龙虾原产于中、南美洲地区，20世纪从日本引入，目前，江苏、浙江、安徽、南海等是我国龙虾主要分布地区[2]。龙虾具有很强的适应能力，在河湖、池塘、水田等各类水体环境中均能生存。作为一种高营养、味道鲜美的食品，龙虾在国内市场独占一隅，据统计，仅江苏南京地区，每年旺季的龙虾日消费量高达90吨，由此也产生了大量的龙虾加工废弃物。龙虾加工废弃物中含有多种营养成分，如虾青素、甲壳素、蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质盐类(钙、镁、磷等)，还含有卵磷脂、脑磷脂、类胡萝卜素等营养成分。

在龙虾加工过程中所产生的龙虾废弃物，如果能得到进一步的利用，必将产生巨大的经济效益。通过对龙虾加工废弃物(主要是虾头和虾壳)中的虾青素、龙虾油、甲壳蛋白等的提取可以实现对龙虾加工废弃物的重复利用。龙虾废弃物中含有多种天然蛋白，张爱军等[3]通过碱法对龙虾废弃物中的甲壳蛋白进行提取，制备甲壳素。目前，国内外关于龙虾加工废弃物中蛋白质提取方法的研究报道较少。

龙虾废弃物中蛋白质的提取方法包括碱提取法[4-5]、酸提取法、水洗提取法、盐提取法、有机溶剂提取法[6-7]、超声波辅助提取法[8-10]和酶解法[11]等，其中超声波辅助提取法和酶解法作为新型的蛋白质提取方法，展现出了高提取率、条件温和等优点[12]。

1 实 验

1.1 材 料

龙虾壳，购于淮安市当地农贸市场，牛白蛋白、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，考马斯亮蓝G250、生化试剂；高锰酸钾、氢氧化钠、氯化钠、盐酸、无水乙醇、磷酸等均为分析纯；去离子水，实验室自制。

1.2 方 法

1.2.1 龙虾壳预处理

取新鲜龙虾若干，将其杀死，除去龙虾虾肉，收集剩余虾壳和虾头，用水冲洗干净，浸泡到95%乙醇中除去虾壳中的黄色素，24 h后过滤洗净，浸泡到5%的盐酸溶液中使龙虾壳完全软化，脱去虾壳中含有的碳酸钙，4 h后过滤并用蒸馏水冲洗3～5遍，烘干待用。

1.2.2 酶辅助提取工艺考察

1.2.2.1 酶辅助提取工艺的单因素

(1)酶的种类对蛋白质提取的影响

称取2份经过预处理过的龙虾壳，每份3.0 g，分别加入0.045 g中性蛋白酶和0.045 g木瓜蛋白酶，加入一定体积的水后，分别置于50 ℃水中酶解，分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h时取样，将样品放置于沸水中20 min灭酶，测量酶解液蛋白质含量。

(2)酶解时间对蛋白质提取的影响

称取5份预处理过的的龙虾壳，每份3.0 g，加入0.045 g中性蛋白酶，加入一定体积的水后，分别置于50 ℃水中恒温酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 后放置沸水中20 min，灭酶。测量酶解液蛋白质含量。

(3)酶解温度对蛋白质提取的影响

称取4份经过预处理过的的龙虾壳，每份3.0 g，加入0.045 g中性蛋白酶，加入一定体积的水后，分别置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃ 水中恒温酶解3 h,后取出放置沸水中20 min，灭酶。测量酶解液蛋白质含量。

(4)加酶量对蛋白质提取的影响

称取4份经过预处理过的龙虾壳，每份3.0 g，分别加入不同量的中性蛋白酶，加酶量取1%、1.5%、2%、2.5%，加入一定体积的水后，分别置于50 ℃水中恒温酶解3 h,后取出放置沸水20 min，灭酶，测量酶解液蛋白质含量

(5)pH值对蛋白质提取的影响

称取4份经过预处理过的的龙虾壳，每份3.0 g，加入一定体积的水后调节pH值分别为6.5、7、7.5、8分别加0.045 g的中性蛋白酶，置于50 ℃水中恒温放置3 h,后取出放置沸水20 min，灭酶，测量酶解液蛋白质含量。

1.2.2.2 酶解提取工艺的优化

称取9份经过预处理过的的龙虾壳，每份3.0 g，按正交试验设计方案进行提取。所以，根据正交试验表安排实验条件列表如表1。

表1 正交试验因素水平表L9(33)Table 1 Orthogonal test factor level L9(33)

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶的种类对酶解效果的影响

由图1可知，随着酶解时间的延长，蛋白质提取率逐渐增大，在2.5 h时，蛋白质提取率达到37.2%并趋于平稳。分析比较其酶解能力，可知中性蛋白酶酶解能力明显优于木瓜蛋白酶，中性蛋白酶在各个提取时间段的蛋白质提取率都高于木瓜蛋白酶。因此，中性蛋白酶可以作为酶解法提取蛋白质的优选提取剂。

图1 蛋白酶的种类对蛋白质提取率的影响Fig.1 The effect of the species of protease on the extraction yield of protein

2.2 酶解时间对蛋白质提取率的影响

由图2可知：随着酶解时间的延长，蛋白质的提取率逐渐增大，在3 h时蛋白质提取率达到最大值并趋于平缓。这可能是由于随着酶解时间的增加，大量的氨基酸暴露，对酶产生抑制作用，阻止酶的继续水解;另一方面，长时间的搅拌，使得中性蛋白酶与空气频繁接触，酶活性有所降低，综合考虑，选择3 h为最佳酶解时间。

图2 酶解时间对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on protein extraction yield

2.3 加酶量对蛋白质提取率的影响

加酶量对酶解效果的影响，由图3可以看出：随着加酶量的增加，蛋白质提取率逐渐增大，加酶量为1.5%时蛋白质提取率达到最大值，继续添加酶后蛋白质提取率降低。原因可能是加酶量低于1.5%时，随加酶量的增加，酶与底物的接触充分，接触面积增加，蛋白质提取率提高；同时由于酶本身也是蛋白质，是被作用物的类似物，加酶量高于1.5%时，添加过多蛋白酶会抑制蛋白酶的酶解能力，最适加酶量为1.5%左右。

图3 加酶量对蛋白质提取率的影响Fig.3 The effect of the amount of enzyme added on the extraction yield of protein

2.4 酶解温度对蛋白质提取率的影响

由图4可知：随着提取温度的增加，蛋白质提取率逐渐增加，50 ℃时提取率达到最大值，然后随着温度的增高呈现逐渐降低的趋势。温度也是蛋白酶制剂的重要活性制约条件。温度偏高会使酶变性，丧失酶活，而温度偏低会抑制酶的活性；温度过高或过低都会导致酶制剂失活，导致提取率下降，最适的提取温度为50 ℃左右。

图4 温度对对蛋白质提取率的影响Fig.4 The effect of temperature on the extraction yield of protein

2.5 pH值对对蛋白质提取率的影响

由图5可知：随pH值的增加，蛋白质提取率提取率逐渐增加，当PH为7.0时提取率达到最大值，然后随着PH的增加蛋白质提取率呈现逐渐降低的趋势。蛋白酶是有活性的生物制剂，pH值是制约其催化活性的重要因素之一，pH值偏低或者偏高对蛋白酶的催化作用具有促进或抑制作用；并且pH过高或者过低都会引起中性蛋白酶的变性或者失活，导致蛋白质提取率下降，中性蛋白酶的最适pH为7.0。

图5 pH值对对蛋白质提取率的影响Fig.5 The effect of pH value on the extraction yield of protein

2.6 酶解正交试验结果

在上述实验的基础上，选取酶解温度、加酶量和pH值3个主要影响因素，进行正交试验设计。选用L9(33)为正交试验表，正交设计与试验结果如表2所示。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

图6 正交设计趋势图Fig.6 Orthogonal design trend diagram

2.7 方差分析

表3 方差分析Table 3 variance analysis

正交试验结果如上图所示，极差分析结果显示3个因素对酶解效果影响的主次顺序为C(pH值)>B(加酶量)>A(酶解温度)；由极差分析可知最优方案为A2B2C2。经验证试验表明A2B2C2组的提取率为43.58%，优于A2B2C3组的42.04%。因此确定A2B2C2为酶解最优方案，即酶解温度为50 ℃、加酶量为1.5%、pH值为7.0，此外单因素确定的最佳酶解时间为3 h。

3 结 论

本课题以龙虾甲壳蛋白的提取率为评价指标，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶辅助提取龙虾中甲壳蛋白。研究表明：中性蛋白酶的提取效率高于木瓜蛋白酶，优选中性蛋白酶。最佳酶辅助提取工艺为：酶解温度50 ℃、加酶量为1.5%、pH值7.0，最佳酶解时间3 h。应用中性蛋白酶辅助提取龙虾中甲壳蛋白不仅可以有效提高甲壳蛋白的提取率，最佳提取收率为43.58%，还可避免提取过程中大量酸碱的使用，可有效降低环境污染，实现甲壳蛋白的绿色高效生产。