DNA镊子型电致化学发光生物传感器高灵敏检测MicroRNA-21

冯 程，张茂美

(常德职业技术学院，湖南 常德 415000)

MicroRNA是一类内源性、非编码的单链短RNA分子，能在翻译和转录过程中调控基因表达[1-2]。他们在许多生物过程中扮演重要角色，如细胞分化、凋亡、增殖、移动、入侵、疾病的产生和癌症的形成等过程[3-4]。microRNA-21正调控于乳腺癌基因。因此，microRNA可作为人类癌症的生物标记物用于癌症的早期诊断[5]。目前，对于microRNA检测传统方法有Northern blot、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和DNA微阵列芯片检测。

电致化学发光(ECL)microRNA生物传感器是将核酸分子碱基互补配对技术和电化学分析方法结合而发展起来的一种灵敏度高、选择性好、响应快速、操作简单的新型生物传感器。为了对microRNA进行高灵敏检测以达到对癌症的早期诊断，新型纳米材料、DNA分子机器被广泛应用于microRNA传感器的构建中，有望成为肿瘤早期诊断的新型分子标志并应用于实际临床研究。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪；CHI610A型电化学工作站；电子天平；超声清洗机；高速台式冷冻离心机；移液枪；三电极体系：玻碳电极(GCE，Φ=4 mm)及其修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极；JBZ-12H 磁力搅拌器； ETC PCR仪， PHS-3C/pH计。

DNA Primer(A、B、C、H1、H2、H3)购于赛默飞世尔科技中国有限公司；microRNA-21购于大连宝生物有限公司；

1.2 实验方法

1.2.1 再生型生物传感器的制备过程

将玻碳电极(GCE，Φ=4 mm)于麂皮上经0.3 μm和0.05 μm的三氧化二铝粉末抛光使成镜面，并用超纯水清洗干净，再依次用超纯水、乙醇、超纯水超声洗涤约5分钟/次，清洗后的电极置于室温下晾干，备用。然后，将电极在-0.2 V恒电位下置于2 mL HAuCl4(1%)溶液中沉积30 s，形成一层致密纳米金层，以固载组装完成的DNA镊子。最后滴加15 μL microRNA-21混合溶液，反应1～2 h。即得生物传感器。

1.2.2 测试方法和原理

2 结果与讨论

2.1 传感器制备过程ECL表征

通过测定修饰电极在2 mL的0.1 mol·L-1PBS(pH=8.0)和1 mL的S2O82-溶液混合溶液中ECL强度变化可以表征传感器的构建过程。在沉积金的电极表面滴加15 μL DNA镊子溶液(1 μmol·L-1)并孵育16 h后，ECL强度如图1中曲线所示，由于DNA镊子上带有量子点QD与AF488，但此时DNA镊子是打开的状态，所以ECL的信号较低。再滴加10 μL的MCH以封闭电极表面的非特异性结合位点，减少非特异性反应。孵育40 min后进行测定，ECL信号如图3.1中b所示，由于MCH具有一定阻碍电子传递的性质，因此ECL信号有所降低。最后滴加microRNA-21混合溶液，孵育2 h，ECL信号如图3.1中c所示，由于microRNA-21混合液的加入，使DNA镊子关闭，量子点与AF488距离很近，因而AF488把能量转移给量子点，使量子点的ECL信号大大增强。

图1 传感器制备过程的ECL表征Fig.1 ECL characterization of sensor preparation process

2.2 传感器制备过程CV表征

通过测定修饰电极在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液中CV强度变化来表征传感器的制备及检测过程。如图2所示曲线a是玻碳裸电极的循环伏安图谱。b是当将纳米金修饰在电极表面后测得的曲线，有一对良好的Fe(CN)33-/4-氧化还原峰，这是因为nano-Au具有优良的导电性。曲线c是固载了DNA镊子，由于DNA镊子上有荧光材料AF488和量子点，可以加强电子传递，所以CV信号增强。曲线d是滴加了MCH封闭剂，由于MCH封闭剂以封闭电极表面的非特异性结合位点，有阻碍电子传递的作业，所以CV信号降低。曲线e是滴加了microRNA-21混合液，DNA分子具有阻碍电子传递的性质，所以CV信号减弱。通过CV表征说明传感器成功制备。

图2 传感器制备过程CV表征Fig.2 CV characterization of sensor preparation process

2.3 实验条件的优化

为了使传感器具有更优异的性能，我们对DNA镊子溶液的浓度、microRNA-21混合溶液中的DNA酶-铅离子的浓度进行了优化。

DNA镊子溶液的优化：首先在沉积金后的电极上分别滴加15 μL 的0.01、0.1、0.5、1、2、3 μmol·L-1)的DNA镊子溶液，孵育16 h后，再各滴加10 μL的MCH封闭40 min，最后滴加15 μL同一microRNA-21检测液，孵育2 h，再检测ECL信号。如图3所示，在DNA镊子的浓度低于1 μmol·L-1时，随着浓度的增大，ECL信号逐渐增强，当DNA镊子的浓度大于1 μmol·L-1时ECL信号基本保持不变，故DNA镊子的最佳浓度为1 μmol·L-1。

图3 DNA镊子溶液浓度的优化Fig.3 DNA tweezers optimization solution

microRNA-21混合溶液的铅离子的浓度的优化：首先在沉积金后的电极上滴加15 μL(1 μmol·L-1)的DNA镊子溶液，孵育16 h后，再滴加10 μL MCH封闭40 min，最后分别滴加15 μL分别含有1、5、10、20、30(μmol·L-1)铅离子的microRNA-21检测液，孵育2 h，最后检查ECL信号。ECL信号如图4所示，在铅离子的浓度小于10 μmol·L-1时，随着浓度的增大，ECL信号逐渐增强。当铅离子的信号大于10 μmol·L-1时ECL信号基本保持不变，所以铅离子的最佳浓度为10 μmol·L-1

图4 Pb2+浓度的优化Fig.4 Optimization of Pb2+ concentration

2.4 ECL生物传感器的ECL信号响应特性

本实验研究了在最优条件下ECL生物传感器孵育了不同浓度的microRNA-21标准混合溶液的传感器的响应特性。实验结果表明：如图5所示，ECL强度随着microRNA-21浓度的增加而增加。因为microRNA-21的浓度越大DNA镊子关闭的越多，所以ECL信号越大。在10 pmol·L-1到0.0001 pmol·L-1浓度范围内，ECL的强度与microRNA-21的浓度呈线性关系(如插图)。线性方程为I=5876.08+1254.98 lgc，相关系数R为0.99468。检出限为0.03 fmol·L-1

图5 传感器对于不同浓度microRNA-21混合溶液的响应曲线Fig.5 sensor response curves for different concentrations of microRNA-21 mixed solution, concentration of microRNA-21 mixed solution

3 结 论

以ECL为基本检测手段，我们实现了对microRNA-21的超灵敏检测。本实验以具有发光效率高、稳定性好的CdSe@ZnS量子点作为电致化学发光体，选择发射光谱较宽的荧光材料AF488作为能量转移供体，量子点作为能量受体接受供体传递的能量，从而有较强ECL响应；并且成功构建基于DNA酶引发的目标物循环放大，以DNA分子机器—DNA tweezer为模板的再生型ECL生物传感器，而实现对microRNA-21的高灵敏检测，建立了一种特异性强、灵敏度高及检测快速的microRNA-21检测方法，对于microRNA的检测具有非常重要的意义，为microRNA-21检测及生物传感领域提供一个新的平台。