夏蒌止鼾颗粒提取、成型工艺的优化

孙岚萍， 顾志荣， 马转霞， 吕 鑫， 张 锐， 祁 梅， 葛 斌

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000)

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)[1]是一种睡眠呼吸紊乱性疾病，主要临床表现为打鼾，鼾声不规律，患者自觉憋气，常伴有夜尿增多、晨起头痛、头晕等[2-3]，还可引起高血压、糖尿病等多种疾病[4]，被称为梦中的“隐形杀手”，常用治疗方法包括药物、持续气道正压通气(CPAP)、口腔矫治器、外科手术等[5-6]，但疗效不佳，临床应用受限，目前仍无特效药物。中药及其复方制剂治疗OSAHS时，常采用化痰利湿、宽胸散结通阳、行气活血导滞等治则，具有疗效确切、作用温和、不良反应小、整体调节等优势[7]。

夏蒌止鼾方是甘肃省人民医院张明德主任中医师拟定的临床经验方，目前应用已超过20年，该方由法半夏、瓜蒌、黄芪、茯苓、陈皮等13味中药组成，具有补气化痰利湿、宽胸散结通阳、行气活血导滞等功效，治疗气虚血瘀、痰瘀互结所致OSAHS取得了较好的效果，但原方存在煎煮费时，服药体积大，服药时间、剂量、次数难以精确化等缺点，故拟将其制成颗粒剂。本实验采用正交实验结合信息熵理论优化夏蒌止鼾颗粒提取工艺，星点设计-效应面法结合G1-熵权法优化该制剂成型工艺，以期为其研发提供技术资料。

1 材料

1.1 仪器 LC-16型高效液相色谱仪[岛津仪器(苏州)有限公司]；UV8100A型紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；AL204型电子天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；BSA4202S-CW型电子天平[百万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；SB25-12DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(西安超杰仪器有限公司)；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DD-5M型低速大容量离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；YC-1000型实验室喷雾制粒包衣机(上海雅程仪器设备有限公司)。

1.2 试剂与药物 法半夏、瓜蒌、连翘、黄芪、陈皮、生地黄、枳实、牛蒡子、泽泻、薤白、当归、甘草、水蛭均购于甘肃冠兰中药饮片有限公司，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》一部相关规定。连翘酯苷A(批号CHB190123)、橙皮苷(批号CHB180523)、梓醇(批号CHB171010)、芒柄花苷(批号CHB171026)对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司；预胶化淀粉、麦芽糊精、甘露醇、微晶纤维素、聚维酮均为药用级辅料。甲醇、甲酸为色谱纯(天津大茂化学试剂厂)；其他试剂均为分析纯(天津大茂化学试剂厂)；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 HPLC法同时测定4种成分含量

2.1.1.1 色谱条件 WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.2%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～7 min，8%～13%A；7～10 min，13%～18%A；10～16 min，18%～21%A；16～58 min，21%～55%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.连翘酯苷A 2.橙皮苷 3.梓醇 4.芒柄花苷

2.1.1.2 对照品溶液制备 精密称取连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷对照品适量，甲醇溶解，即得(质量浓度分别为0.90、1.00、1.50、0.27 mg/mL)，避光冷藏备用。

2.1.1.3 供试品溶液制备 精密吸取提取液7 mL，加10 mL甲醇摇匀，超声提取60 min，放冷，甲醇补足减失的质量，4 000 r/min离心10 min，取上清液，溶剂回收至干，加水溶解，置于25 mL量瓶中，定容，即得。

2.1.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1.2”项下对照品溶液0.1、0.2、0.4、1、2、4 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.1.1.5 精密度试验 取“2.1.1.2”项下对照品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面积RSD分别为1.86%、1.72%、1.47%、1.52%，表明仪器精密度良好。

2.1.1.6 重复性试验 取提取液6份，按“2.1.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，测得连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量RSD分别为1.67%、1.97%、1.17%、1.39%，表明该方法重复性良好。

2.1.1.7 稳定性试验 取“2.1.1.3”项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，测得连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面积RSD分别为1.09%、1.93%、1.46%、1.95%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.1.8 加样回收率试验 精密吸取“2.1.1.3”项下各成分含量已知的供试品溶液3.5 mL，共6份，精密加入对照品溶液，按“2.1.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷平均加样回收率为100.09%、101.56%、100.17%、99.43%，RSD分别为1.96%、2.11%、2.03%、1.87%。

2.1.2 单因素试验

2.1.2.1 加水量 精密称取处方量药材约126 g，共5份，浸泡12 h后分别加8、10、12、14、16倍量水，按“2.1.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，加14倍量水时各成分峰面积开始呈下降趋势，故选择12、14、16倍作进一步考察。

2.1.2.2 提取时间 煎煮时间设定为30、60、90、120、150 min，其余同“2.1.2.1”项，结果见图2。由此可知，随着提取时间延长，各成分含量升高，但提取60 min后开始呈下降趋势，故选择30、60、90 min作进一步考察。

2.1.2.3 提取次数 煎煮次数设定为1～4次，其余同“2.1.2.1”项，结果见图2。由此可知，增加提取次数时各成分含量呈先升后降的趋势，故选择1～3次作进一步考察。

图2 各因素对提取效果的影响

2.1.2.4 正交试验 在单因素试验基础上，以提取次数(A)、提取时间(B)、加水量(C)为影响因素，连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量，干膏率，指纹图谱相似度为评价指标，采用L9(34)正交试验优化提取工艺[8]。因素水平见表2。

称取处方量药材约126 g，共9份，按表2因素水平提取，按“2.1.1.3”项下方法制备9份供试品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，计算各成分含量。精密吸取水煎液10 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥至恒重，取出，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算干膏率。结果见表3。

表2 提取工艺因素水平

表3 试验设计及结果(Ⅰ)

2.1.2.5 指纹图谱建立及相似度评价 吸取“2.1.2.4”项下供试品溶液，在“2.1.1.1”项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”生成指纹图谱，中位数法建立对照图谱(R)，结果见图3。

图3 9批样品HPLC指纹图谱

2.1.2.6 信息熵理论 建立原始评价指标矩阵X，将其转换为概率矩阵P，计算权重系数[9]、信息熵(Hi)、i项指标的系数Wi、综合评分M，Hi=[0.984 0，0.989 7，0.987 0，0.992 2，0.993 0，0.992 8]，Wi=[0.261 0，0.168 0，0.212 1，0.127 2，0.114 2，0.117 5]，M=[(Xi连翘酯苷A/Xmax连翘酯苷A×0.261 0+Xi橙皮苷/Xmax橙皮苷×0.168 0+Xi梓醇/Xmax梓醇×0.212 1+Xi芒柄花苷/Xmax芒柄花苷×0.127 2+Xi干膏率/Xmax干膏率×0.114 2+Xi相似度/Xmax相似度×0.117 5)×100]。结果见表3。

2.1.2.7 方差分析 表4显示，各因素影响程度依次为A>B>C，即提取次数>提取时间>加水量，其中因素A有显著影响(P<0.05)，而B、C无显著影响(P>0.05)。结合单因素试验和方差分析结果，确定最优工艺为A3B3C2，即加14倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

表4 方差分析(Ⅰ)

2.1.2.8 验证试验 精密称取处方量药材约126 g，共4份，按“2.1.2.7”项下优化工艺进行4批验证试验，结果见表5。由此可知，各指标RSD均小于3%，表明该工艺稳定可行。

表5 提取工艺验证试验结果(n=4)

2.2 成型工艺优化

2.2.1 颗粒制备 按处方称取药材，加入14倍量水煎煮3次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，喷雾造粒机喷雾干燥后制得干燥恒重浸膏粉，按相应浸膏粉辅料比例混合制成软材(“握之成团，触之即散”)，过20目筛，采用挤压制粒法制粒，60 ℃下烘干，整粒，即得。

2.2.2 指标测定

2.2.2.1 吸湿率 参考文献[10]报道，精密称取颗粒2 g，置于干燥恒重敞口的扁形称量瓶中，轻摇使其分布均匀，放入盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器内，密封48 h后称定质量，计算吸湿率，公式为吸湿率=[(吸湿后颗粒质量-吸湿前颗粒质量)/吸湿前颗粒质量]×100%。

2.2.2.2 成型率 参考文献[11]报道，收集通过1号筛而不通过5号筛的合格颗粒，称定质量，计算成型率，公式为成型率=(合格颗粒质量/颗粒总质量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 参考文献[12]报道，精密称取颗粒1 g，置于50 mL恒重离心管中，加入沸水20 mL，搅拌并振摇5 min，4 000 r/min离心10 min，80 ℃下将残渣烘干至恒重，称定质量，计算溶化率，公式为溶化率=(溶化的颗粒质量/颗粒总质量)×100%。

2.2.2.4 休止角 参考文献[13]报道，采用固定漏斗法，将3只漏斗串联固定于铁架台，最下方漏斗口距离坐标纸1 cm(H)，将颗粒由漏斗壁倒入最高处漏斗口中，待坐标纸上颗粒椎体顶端触及漏斗下沿时停止，记录锥体底部直径为2R，计算休止角α，公式为α=arctan(H/R)。

2.2.2.5 堆密度 参考文献[14]报道，将颗粒置于恒重量筒中反复振荡，记录体积，称定颗粒质量，计算堆密度，公式为堆密度=颗粒质量/颗粒体积。

2.2.3 辅料筛选 本实验选择预胶化淀粉、麦芽糊精、甘露醇、微晶纤维素、聚维酮进行考察，由于浸膏粉黏性较大，故以95%乙醇为润湿剂，设定浸膏粉与辅料比例为1∶1，润湿剂用量为浸膏粉与辅料总质量的0.38倍，按“2.2.1”项下方法制备颗粒，测定其吸湿率、成型率、溶化率，结果见表6，最终确定甘露醇、麦芽糊精作为辅料。

表6 不同辅料对成型工艺的影响

2.2.4 星点设计-效应面法 在单因素试验基础上，以乙醇用量(A)、浸膏粉与辅料比例(B)、甘露醇与麦芽糊精比例(C)为影响因素，吸湿率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)为评价指标，采用星点设计-效应面法优化成型工艺。因素水平见表7。

表7 成型工艺因素水平

2.2.5 G1-熵权法 根据G1法[15-16]，确定各评价指标影响程度依次为X1>X2=X3>X4>X5，并确定其权重评价标度，其中r2=1.6，r3=1.0，r4=1.2，r5=1.4，计算各指标主观权重值(w1)，根据熵权法计算各指标客观权重值(w2)，根据式(1)计算组合权重(w)，结果见表8。再计算综合评分Y，结果见表9。

表8 评价指标权重值

表9 试验设计与结果(Ⅱ)

(1)

2.2.6 模型拟合与方差分析 采用Design-Expert 8.0.6软件对表9数据进行拟合，得方程为Y=-55.810 17+426.726 61A+111.786 02B+39.079 55C-11.783 75AB+81.911 25AC-29.349 40BC-760.881 43A2-37.247 88B2-15.253 18C2，方差分析见表10。

表10 方差分析(Ⅱ)

2.2.7 响应面分析 通过Design-Expert 8.0.6软件进行分析，结果见图4。由此可知，模型最大值点为乙醇用量0.34倍，浸膏粉与辅料比例为1∶0.93，甘露醇与糊精比例1.31∶1，综合评分为95.094 0分，即为最优工艺。

图4 各因素响应面图

2.2.8 验证试验 按优化工艺制备5批颗粒，进行验证试验，结果见表11。由此可知，平均综合评分与预测值95.094 0分接近，偏差率仅为-1.12%，表明模型预测性良好，可用于工艺参数的优化。

表11 成型工艺验证试验结果(n=5)

2.2.9 临界相对湿度测定 参考文献[17]报道，在棕色玻璃干燥器中配置7种盐过饱和溶液，室温下放置48 h，使内部湿度平衡，将干燥至恒重的2 g颗粒置于恒重称量瓶中，均匀摊开，敞口放于相对湿度不同的干燥器中，室温下放置48 h后精密称定质量，计算吸湿率，结果见表12。以吸湿率为纵坐标(Y)，相对湿度为横坐标(X)绘制曲线，在吸湿曲线前后拐点处作切线(分别为Y=0.102 6X-0.644 4、Y=0.783 9X-48.815 5)，两切线交点对应的横坐标即为临界相对湿度，结果见图5，可知该数值为70.45%。

表12 颗粒吸湿率测定结果

图5 颗粒吸湿曲线

3 讨论

中药饮片的优劣会直接影响夏蒌止鼾颗粒成型，本研究所用均来自医院中药库，有质量检验报告，经验收人员鉴定为正品后，再经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定，符合2015年版《中国药典》一部相关规定。中药复方提取液中活性成分含量对制剂的质量和疗效起着至关重要的作用，在煎煮过程中易受到加水量、煎煮时间、煎煮次数等因素影响[18]，本研究选择多指标成分，再通过客观赋权法得到综合评价指标，从而筛选提取工艺。

中药复方组成药味繁多，成分复杂，而临床疗效是由方中许多活性成分协同发挥作用的，故评价指标的选择是其提取工艺研究中十分重要的环节[19]。本实验选取方中君药或臣药的指标成分或有效成分来进行优化，其中连翘酯苷A具有抗氧化、抗炎功效[20]，可改善OSAHA患者呼吸紊乱指数及最低血氧饱和度；橙皮苷具有抗氧化应激、降低脂质过氧化物水平的作用，可抑制氧化应激及炎症反应；梓醇具有抗脑缺血损伤、抗氧化等作用[21]，能降低MDA水平，抑制炎性细胞因子释放；芒柄花苷是重要的黄酮类成分，具有抗氧化作用。另外，干浸膏含有大多数上述有效成分或有效部位，能更全面地反映复方物质基础。因此，本实验选择连翘酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷及干膏率作为评价指标。

采用星点设计-效应面法优化夏蒌止鼾颗粒成型工艺时，能较大程度地避免各指标之间优化条件的相互交叉。对综合评分分别进行多元线性回归、二项式方程拟合分析，发现后者拟合效果较好，失拟项无显著差异。验证试验结果与模型方程理论值之间的偏差在合理范围内，表明拟合模型准确可靠，优化工艺稳定可行，重复性较好。但实验室小试所优化的提取、成型工艺可能存在某些不足，故今后将进行中试，以期为夏蒌止鼾颗粒的工业化大规模生产提供重要依据。