白杨素磷脂复合物固体分散体的制备及其体内药动学研究

庞 榕， 李开言， 王聪颖

(1.黄河科技学院医学院，河南 郑州 450005；2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)

白杨素是蜂胶主要有效成分，也可从紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，具有抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗糖尿病、预防心脑血管疾病等作用[1-2]，研发价值较高，但由于该成分水溶性和脂溶性较差，口服生物利用度较低，导致临床应用受到很大限制[3]。崔晓鸽等[3]采用磷脂复合物技术，在一定程度上提高了白杨素体内吸收，但其疏水性较强，从而影响了药物溶解度和溶出度[4-8]，故需要联合其他制剂技术以进一步提高其口服吸收生物利用度。

固体分散体是指通过熔融法、溶剂挥发法等制剂技术，将药物分散于亲水载体(如PVP K30等)中的一种固体粉末，有助于增加亲水性，改善溶解度，提高溶出速率和溶出度，也可进一步促进药物口服吸收[9-12]。因此，本实验采用聚乙烯吡咯烷酮 K30(PVP K30)将白杨素磷脂复合物进一步制成固体分散体，对其存在状态、溶解度、体外溶出等进行了研究，并考察了其体内药动学。

1 材料

1.1 仪器 UW220H型电子分析天平(日本岛津公司)；U3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)； YSCL-3A型集热式加热磁力搅拌器(上海秋佐科技设备有限公司)；TR6120-AT型溶出试验仪(配置自动取样仪，深圳市锐拓仪器设备有限公司)；HT-110X50型恒温振荡器(上海赫田科学仪器有限公司)；SPR-DT12A-12型智能药物溶出仪(天津赛普瑞实验设备有限公司)；D8 ADV型X射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)。

1.2 试剂与药物 白杨素对照品(纯度99.1%，批号111701-201501，中国食品药品检定研究院)；白杨素原料药(纯度>98.5%，批号171213P，西安一品生物科技有限公司)。大豆磷脂(批号191005，辅必成医药科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批号201548234-3，德国巴斯夫公司)。四氢呋喃为色谱纯(德国Merck公司)；正辛醇(批号190915)、无水乙醇(批号191110)(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，雌雄兼用，体质量(280±20)g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK-2016-0001，饲养于相对湿度40%～55%、温度20～25 ℃环境下。

2 方法与结果

2.1 白杨素含量测定

2.1.1 色谱条件 ZORBAX SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸(55∶45)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长268 nm；进样量20 μL。

2.1.2 线性关系、方法学考察 精密称取白杨素对照品20 mg，溶于100 mL乙腈中，作为贮备液(0.2 mg/mL)，精密量取适量，“2.1.1”项下流动相稀释至10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以白杨素质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=19.481 4X-2.159 1(r=0.999 6)，在0.5～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

取10.0、5.0、0.5 μg/mL上述溶液各3份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得日内精密度RSD分别为0.12%、0.16%、0.24%，日间精密度RSD分别为0.51%、0.47%、0.83%。取约10 mg白杨素磷脂复合物固体分散体至100 mL量瓶中，流动相溶解定容，过滤后取续滤液5 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，作为供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素峰面积RSD为1.06%，表明溶液在24 h内稳定性良好。取白杨素含量已知的磷脂复合物10 mg，分别加入贮备液1、1.5、2.0 mL，同法制备供试品溶液各3份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素平均加样回收率分别为100.14%、99.83%、99.69%，RSD分别为1.06%、0.83%、1.34%。取对照品溶液适量，流动相逐步稀释，分别以信噪比(S/N)10、3为定量限、检测限，测得两者分别为10、5 ng/mL。

2.2 白杨素磷脂复合物及其固体分散体制备 称取白杨素25.4 mg、磷脂93.6 mg(摩尔比为1∶1.2)，加入四氢呋喃后密封,置于45 ℃水浴中磁力搅拌4 h，减压旋蒸，即得磷脂复合物，为浅黄色半固体状的残留物，置于干燥器中保存。同法制备3批，参考文献[3]报道测得其复合率均接近100%。

取白杨素磷脂复合物、PVP K30 适量，加入无水乙醇得混悬液，密封，置于45 ℃水浴中磁力搅拌至溶液澄清，减压旋蒸得残留物，即得固体分散体，粉碎，过60目筛，保存于干燥器中备用。

2.3 体外释放研究 取白杨素磷脂复合物及不同载体比例的固体分散体(以白杨素计，含量均为15 mg)，加入3 mL空白溶出介质配制混悬液，转入透析袋中并扎紧[12](截留分子量为8 000～14 000 Da)，设定仪器温度、转速分别为37 ℃、100 r/min，溶出介质为0.5%SDS溶液，体积为900 mL，于0、15、30、60、90、120、240、360、480、720 min各取样3 mL，补加3 mL空白溶出介质，维持总体积不变，6 000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。

2.4 磷脂复合物与载体比例筛选 图1显示，原料药720 min内累积溶出度仅为20.92%，而磷脂复合物提高至43.51%；磷脂复合物与载体PVP K30比例为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8时，均可提高白杨素溶出速率和溶出度，而且随着后者用量增加更明显，综合考虑溶出速率、溶出度、固体分散体中药物含量等因素，最终确定两者比例为1∶6。

图1 白杨素体外溶出曲线

2.5 X射线粉末衍射(XRPD)分析 取原料药、物理混合物(白杨素+磷脂+PVP K30)、磷脂复合物、固体分散体适量，置于玻璃内槽中，玻璃片压制平整后进行XRPD扫描，设定条件为Cu-Kα靶，电压40 kV，范围(2θ)3°～45°，速度8°/min，结果见图2。由此可知，原料药图谱中可见特征晶型峰，并且在物理混合物图谱中仍存在；虽然磷脂XRPD图谱中也有晶型峰[3]，但本实验在物理混合物图谱中未发现，这与PVP K30用量远大于磷脂用量有关，导致后者XRPD被掩盖；磷脂复合物图谱中无白杨素特征晶型峰，表明该成分以无定型状态存在；在固体分散体图谱中也未发现白杨素特征晶型峰，表明该成分仍以无定型状态存在。

注：A～E分别为白杨素、PVP K30+磷脂、物理混合物、白杨素磷脂复合物、白杨素磷脂复合物固体分散体。

2.6 溶解性研究 取过量原料药、磷脂复合物、固体分散体适量，置于三角瓶中，加入适量正辛醇或蒸馏水，25 ℃水浴中磁力搅拌12 h，取上层混悬液，6 000 r/min离心5 min，取上清液过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见表1。由此可知，将白杨素制成磷脂复合物后，在水、正辛醇中表观溶解度分别提高至3.21、11.11倍(P<0.01)；将磷脂复合物进一步制成固体分散体后，在正辛醇中表观溶解度无明显变化(P>0.05)，而在水中提高了3.53倍(P<0.01)，表明将磷脂复合物制成固体分散体后可大大提高前者水溶性，而且对脂溶性无影响。

表1 白杨素表观溶解度测定结果

2.7 体内药动学研究

2.7.1 药液制备 取原料药、磷脂复合物、固体分散体适量，0.5%CMC-Na溶液制成含2 mg/mL白杨素的混悬液，即得。

2.7.2 分组、给药与采血 取大鼠18只，给药前禁食12 h，随机分为3组，分别灌胃给予“2.7.1”项下3种药液，剂量均为20 mg/kg。参考文献[3]报道及预实验结果，乙醚麻醉大鼠后于0.167、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、12 h迅速眼眶采血0.2～0.3 mL，置于肝素抗凝处理的离心管中，手动振荡，2 500 r/min离心20 min，取血浆，密封，保存在冰箱冷冻层。

2.7.3 血浆样品处理 量取正己烷100 mL、二氯甲烷50 mL、异丙醇10 mL，混匀后超声提取5 min，作为血浆样品提取液，室温解冻后取100 μL至离心管中，加入内标溶液(称取柚皮素对照品10 mg，溶于25 mL乙腈中，即得，质量浓度为400 ng/mL)80 μL、提取液3 mL，于通风橱中涡旋混合5 min，静置30 min，转移有机相至空白离心管中，45 ℃氮气吹干(注意控制氮气体积流量)，加入100 μL流动相复溶，8 000 r/min离心5 min后进样分析。

2.7.4 血浆对照品溶液制备及线性关系考察 取“2.1.2”项下白杨素对照品贮备液，乙腈逐步稀释至20、50、100、500、1 000、1 500 ng/mL，各取500 μL，45 ℃氮气吹干后加入500 μL大鼠空白血浆，即得质量浓度为20、50、100、500、1 000、1 500 ng/mL的血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以白杨素、内标(柚皮素)峰面积比值为纵坐标(Y)，白杨素质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=0.168 3X+0.101 2(r=0.993 4)，在20～1 500 ng/mL范围内线性关系良好。

2.7.5 方法学考察 取20、500、1 500 ng/mL血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为2.16%、1.95%、2.00%，6 d内日间精密度RSD分别为10.14%、8.43%、5.69%，表明该方法精密度良好。取血浆样品，按 “2.7.3”项下方法处理，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素、内标峰面积比值RSD为9.18%，表明样品稳定性良好。取1只大鼠，按20 mg/kg剂量灌胃给予白杨素混悬液，1.5 h后眼眶采血约3.5 mL，处死，取血浆，分为6份，按“2.7.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素、内标峰面积比值RSD为10.83%，表明该方法重复性良好。取大鼠空白血浆，配制低(20 ng/mL)、中(500 ng/mL)、高(1 500 ng/mL)质量浓度样品溶液，按“2.7.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率在87.19%～97.46%之间。取20 ng/mL血浆对照品溶液，逐步稀释后在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得检测限约为2.0 ng/mL，定量限约为5.0 ng/mL。

2.7.6 结果分析 血药浓度-时间曲线见图3，再采用3P97程序统计矩模型计算药动学参数，结果见表2。由此可知，与原料药比较，磷脂复合物Cmax、AUC0～t升高(P<0.05，P<0.01)，与文献[3]报道基本一致；与磷脂复合物比较，固体分散体tmax缩短(P<0.05)，Cmax、AUC0～t升高(P<0.01)。另外，磷脂复合物、固体分散体相对生物利用度分别增加至1.44、2.16倍。

图3 白杨素血药浓度-时间曲线(n=6)

表2 白杨素主要药动学参数

3 讨论

磷脂分子中2条长脂肪链包裹白杨素分子，同时通过氢键、范德华力等作用力结合在一起而形成磷脂复合物[11]，它继承了磷脂既亲水又亲脂的特性，从而使白杨素水溶性、脂溶性均有所提高，但前者幅度一般不大，这是因为磷脂是一种疏水性物质，而且磷脂复合物一般以半固体形式存在，分散性差，在一定程度上影响了药物体外溶出度，不利于其生物利用度的提高[13]。

本实验结果显示，固体分散体可提高白杨素磷脂复合物的水溶性及体外溶出度，可能是由于亲水性材料PVP K30包裹了磷脂复合物，从而增强了其亲水性，而且PVP K30用量是磷脂复合物的6倍，可使后者高度分散于载体材料中，有助于提高其水溶性、溶出速率、溶出度，促进药物吸收。目前，已有关于白杨素口服纳米制剂的报道[14-15]，但其包封率、载药量均不高，制备工艺复杂；本实验报道的白杨素磷脂复合物固体分散体制备工艺更为简单，适合国内中药制药公司的实际生产水平。

综上所述，将白杨素磷脂复合物制成固体分散体后，可解决其水溶性差、溶出速率及累积溶出度低的问题，并能进一步促进药物吸收[16-17]。但药物经胃肠道吸收进入血液循环的过程较为复杂，与其水溶性、脂溶性、酶降解作用等因素均有很大关系，而现有制剂技术无法解决药物所有的吸收瓶颈，导致口服生物利用度的改善情况也会受到影响，今后将作进一步研究。