慢性肾脏病患者肠道菌群特征及其与微炎症因子水平的相关性探讨

梁 洁 廖安全 叶昌荣 吴婉倩

广东省河源市人民医院肾内风湿免疫科，广东河源 517000

有关数据调查结果显示，慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患病率为10.8%，CKD的患病率呈逐年上升趋势[1]。目前，终末期CKD患者主要以血液透析、腹膜透析及肾移植为肾脏替代治疗方式，虽然能改善患者症状，但是远期预后较差，给患者及其家庭带来心理及经济负担。既往研究表明：在健康人群的胃肠道内寄居着多种微生物[2]，包括对身体有益的微生物群（革兰氏阳性菌、双歧杆菌等）、潜在的致病菌（铜绿假单胞菌、大肠杆菌等），这些微生物在人体肠道内处于共生状态，保持着一种动态的平衡状态，发挥代谢、营养及增强免疫力的作用，能促进免疫系统发育，维持正常的免疫功能。然而，当该平衡被打破后，将会增加胃肠道疾病的发生率[3-4]。同时，持续的肠道菌群异常会引起系统炎症，导致患者预后不良。临床上对于两者的关系缺乏统一标准[5-6]。因此，本研究以CKD非透析患者及健康体检者为对象，探讨CKD患者肠道菌群特征及与微炎症因子水平的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年7月至2020年6月河源市人民医院肾内风湿免疫科收治的35例CKD非透析患者为研究对象，设为观察组，女15例，男20例，年龄41～78岁，平均（56.95±5.61）岁；体质 量 指 数（body mass index，BMI）18 ～ 27 kg/m2，平均（23.26±3.25） kg/m2；病 程 1～ 7个 月，平 均（3.69±0.72）个月；有饮酒史12例，有吸烟史8例；选择38名同期健康体检者设为对照组，女16例，男22例，年龄40～77岁，平均（57.11±5.65）岁；BMI 17 ～ 28 kg/m2，平均（23.31±3.27） kg/m2；体检人群中，有饮酒史11例，有吸烟史12例。两组患者一般资料比较，差异无统计意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①符合《改善全球肾脏病预后组织指南》[7]中CKD诊断标准，患者肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）＜ 30 ml/（min·1.73m3）；②均完成肠道微生物及微炎症因子测定，且患者均可耐受；③具有完整的一般资料与随访资料。排除标准：①合并精神异常、消化系统疾病或治疗史者；②妊娠期、哺乳期或严重心、肝功能异常者；③近期服用抗生素、益生菌等影响肠道菌群药物者；④行肾脏替代治疗（包括血透、腹透、肾移植）者。

1.3 研究方法

（1）肠道菌群测定。采用实时荧光定量PCR法测定两组粪便中长双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、粪肠球菌及大肠杆菌，具体方法如下：①标本采集及总DNA的提取。所有患者入院后均使用无菌采样盒收集患者24 h内粪便标本，并将其放置于粪菌DNA提取液中。根据E.Z.N.A.R soil试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，生产批号：20184915）说明书完成总DNA的提取，采用NanoDrop2000完成DNA浓度与纯度测定。前述操作完毕后采用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳完成DNA提取质量的检测[8]。②对采集的粪便标本采用PCR法（南京伊若达仪器设备有限公司，生产批号：20193815）检测粪便中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、粪肠球菌及大肠杆菌的mRNA表达，设定PCR参数，30℃下操作10 min、42℃处理 30 min、99℃下处理 5 min、5℃下处理5 min，合计完成35个循环，最终10 min延长，温度72℃。将最终获得的产物置于浓度为1.5%琼脂凝胶电泳，且测定完毕后采用Silva数据库进行对比[9-10]。（2）炎症因子测定。两组患者入院后次日清晨取外周空腹血 3 ml，4500 r ，35 min 离心，分离出的血清采用免疫比浊法测定两组C反应蛋白（c-reactive protein，CRP）水平；采用ELISA法测定两组白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，试剂盒均购于美国R&D systems公司，生产批号：20191836[11-12]。参考值：CRP参考值＜5 mg/L；TNF-α参考值：0.10～2.31 ng/L；IL-6参考值：0～8 ng/L；（3）相关性分析。采用Pearson软件对CKD患者肠道菌群特征与微炎症因子水平进行相关性分析。

1.4 观察指标

①肠道菌群结果。记录两组双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、粪肠球菌及大肠杆菌结果；②炎性因子。记录两组CRP、IL-6、TNF-α水平；③相关性分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件处理分析数据，计量资料行t检验，采用（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者肠道菌群结果比较

观察组CKD患者双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；粪肠球菌及大肠杆菌均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组肠道菌群结果比较（，lgCFU/g）

表1 两组肠道菌群结果比较（，lgCFU/g）

组别 n 双歧杆菌 嗜酸乳酸杆菌 粪肠球菌 大肠杆菌观察组 35 6.37±1.12 5.53±0.89 7.41±0.798.95±1.12对照组 38 10.49±1.51 6.78±0.95 6.32±0.677.12±0.83 t值 7.416 6.092 6.778 9.135 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 两组患者炎性因子比较

观察组CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者炎性因子比较（）

表2 两组患者炎性因子比较（）

组别 n CRP（mg/L） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）观察组 35 7.34±0.71 153.69±21.59 285.34±25.62对照组 38 2.32±0.43 72.45±6.71 114.29±18.43 t值 6.392 8.991 6.031 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 CKD患者肠道菌群特征与微炎症因子水平相关性

Pearson相关分析结果显示，CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平与双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌数量呈负相关性（P＜0.05），与粪肠球菌及大肠杆菌数量呈正相关性（P＜0.05）。见表3。

表3 CKD患者肠道菌群特征与微炎症因子水平相关性

3 讨论

既往研究表明[13-14]：CKD与肠道菌群存在紧密的联系，具有相互影响作用。CKD患者肠道菌群的数量与构成与正常人相比发生一定变化，肠道菌群紊乱亦可影响CKD患者病情，且菌群产生的分子为尿毒症毒素的重要组成部分。因此，加强CKD患者肠道菌群测定，能够了解患者微生态失衡的机制，指导临床治疗，避免肠道菌群失调，为CKD诊疗提供新途径[15]。本研究中，观察组CKD患者双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌水平低于对照组（P＜0.05）；粪肠球菌及大肠杆菌均高于对照组（P＜0.05），提示CKD患者常伴有肠道菌群紊乱，主要表现为有害菌的增多及有益菌的减少。通过对肠道微生物进行细致的研究及定量分析，能够增加对于CKD发生的理解。既往研究表明正常人群肠道内菌群维持相对平衡，但是CKD患者将会引起肠道菌群失衡。本研究中，观察组CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于对照组，提示CKD患者常伴有炎症因子的高表达，主要是由于CKD患者发病后炎症在多种因素作用下，引起单核巨噬细胞系统激活，造成机体处于微炎症状态。同时，患者发病后机体内的代谢废物随着肾脏清除能力的下降而在体内蓄积，从而刺激机体产生炎症因子，持续的炎症因子亦可增加CKD发生率[16]。为了进一步分析CKD患者肠道菌群与炎症因子的关系，本研究结果显示：CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平与双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌数量呈负相关性，与粪肠球菌及大肠杆菌数量呈正相关性，提示CKD患者肠道菌群与微炎症状态有关，加强患者肠道菌群测定能够指导临床治疗。但是，本研究亦存在诸多局限性，如纳入病例数较少，需要加大样本量进一步验证。

综上所述，CKD患者常伴有肠道菌群紊乱，且与微炎症因子水平存在相关性，期待能够为临床治疗提供更多参考。