RP-HPLC测定人血浆中伏立康唑浓度及其应用分析

吴水发 林志强 洪丽绵 张清泉 陈喆鸣 陈婷婷

福建医科大学附属泉州第一医院药剂科，福建泉州 362000

伏立康唑（Voriconazole）是第二代三氮唑类抗真菌药物，抗菌谱广，对曲霉菌、念珠菌、隐球菌等深部真菌感染疗效显著，常用于侵袭性真菌病的治疗与预防[1-3]。伏立康唑还可用于治疗耐氟康唑念珠菌、镰刀菌属、足放线菌属引起的严重感染[4-5]。

伏立康唑血药浓度个体差异较大，易受CYP2C19基因多态性等因素的影响[6-8]。伏立康唑主要经CYP2C19代谢，部分经CYP2C9和CYP3A4代谢，同时伏立康唑能抑制这3种酶的活性，药物相互作用较复杂[9]。使用伏立康唑的患者中约15%出现明显的不良反应，约30%疗效欠佳[10]。因此，伏立康唑在临床应用中有必要进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）。本研究拟建立一种反相高效液相色谱法，用于测定人血浆中伏立康唑浓度。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

岛津高效液相色谱仪（LC-20AT型）；HC-2516高速离心机（安徽中科中佳科技仪器有限公司）；25BTS万分之一电子天平（Satorius公司）；WXH微型涡旋混合器（上海跃进医疗器械厂）；MGS-2200C氮吹仪（EYELA，日本）。

1.2 试剂与药品

伏立康唑化学对照品（中国食品药品检定研究院，批号100862-201903）；卡马西平化学对照品（中国食品药品检定研究院，批号100142-201706）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司公司，色谱纯）；乙腈（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。空白血浆为健康人血浆，由福建医科大学附属泉州第一医院（本院）检验科提供。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack Scepter C18-120（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（57：43，V/V）；等度洗脱；流速：1.1 ml/min；柱温：38 ℃；LC停止时间（L）：16 min；PDA结束时间（E）：16 min；检测波长：255 nm；进样量：100 µl。

1.3.2 溶液及质控品配备 伏立康唑标准品溶液：精密称取伏立康唑10.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度。量取该伏立康唑贮备液适量，用甲醇稀释，制得一系列伏立康唑标准品溶液，质量浓度分别为 0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 和 160.0 µg/ml。

卡马西平内标溶液：称取卡马西平10.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度。量取该卡马西平贮备液适量，用甲醇稀释，制得一系列卡马西平内标溶液，质量浓度分别为5、20、80 µg/ml。

伏立康唑质控（QC）血浆样本：吸取450 µl空白血浆，加入50 µl伏立康唑标准品溶液，制得伏立康唑高、中、低3个浓度QC血浆样本，质量浓度分别为 8、2、0.5 µg/ml。

卡马西平QC血浆样本：吸取450 µl空白血浆，加入50 µl卡马西平内标溶液，制得卡马西平高、中、低3个浓度QC血浆样本，质量浓度分别为8、2、0.5 µg/ml。

1.3.3 血浆样品预处理 ①加入乙腈600 µl，涡旋振荡3 min，14 500 r/min离心5 min。②取全部上清，加入乙酸乙酯∶正己烷（4 ∶ 1，V/V）500 µl，涡旋振荡1 min，15 000 r/min离心5 min。③吸取全部上层有机相，50℃下氮气吹干。④残渣用300 µl流动相复溶，涡旋振荡3 min。14 500 r/min离心5 min。⑤取250 µl于进样瓶中，进样量100 µl。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性考察 分别取空白血浆、空白血浆+伏立康唑标准品溶液、空白血浆+卡马西平内标溶液、空白血浆+伏立康唑标准品溶液+卡马西平内标溶液、患者血浆+卡马西平内标溶液，总体积均为 500 µl，按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析。

1.4.2 伏立康唑标准曲线与最低定量限考察 伏立康唑标准曲线：分别取450 µl空白血浆，加入50 µl伏立康唑标准品溶液，使伏立康唑标准品溶液终浓度分别为 0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 和 16.00 µg/ml，再各加入 50 µl质量浓度为20 µg/ml的卡马西平内标溶液。按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析。以伏立康唑峰面积（A）与卡马西平峰面积（AI）比值即A/AI为纵坐标，以伏立康唑浓度为横坐标，采用最小加权二乘法进行线性回归分析。

最低定量限：取0.03125 µg/ml的伏立康唑标准品溶液，平行检测5次，以考察灵敏度。

1.4.3 提取回收率考察 假设A为伏立康唑/卡马西平高、中、低3个浓度QC血浆样本，B为用流动相配置成与A相同浓度的高、中、低3个浓度的伏立康唑/卡马西平标准溶液样本。A、B所取体积均为500 µl，每个浓度取5个样本。按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析，计算提取回收率。提取回收率=A峰面积/B峰面积。

1.4.4 准确度和精密度考察 取伏立康唑高、中、低3个浓度QC血浆样本各450 µl，再各加入50 µl质量浓度为20 µg/ml的卡马西平内标溶液。按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析。每个浓度取5个样本，连续检测3 d，计算日内及日间精密度。

1.4.5 稳定性考察 从3个条件进行稳定性考察：①室温稳定性：室温放置24 h；②长期冷冻稳定性：于-20 ℃冷冻保存3个月；③反复冻融稳定性：反复冻融3次。取伏立康唑高、中、低3个浓度QC血浆样本各450 µl，再各加入50 µl质量浓度为20 µg/ml的卡马西平内标溶液。按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析。每个条件每个浓度各取5个样本，计算实测值。

1.4.6 实用性考察 以临床实际检测样本为例，考察方法学的实用性。取患者血浆500 µl，加入50 µl质量浓度为20 µg/ml的卡马西平内标溶液。按“1.3.3”项预处理，按“1.3.1”项色谱条件进样分析。

2 结果

2.1 专属性

伏立康唑和卡马西平色谱峰完全分离，峰形良好，其中卡马西平色谱峰保留时间约8.8 min，伏立康唑保留时间约13.1 min。本方法专属性较好。见图1。

图1 血浆中伏立康唑和卡马西平的高效液相色谱图

2.2 伏立康唑标准曲线与最低定量限

伏立康唑标准曲线方程为y=0.3791x+0.0039（R2=0.9992，N=10）。伏立康唑在0.03125～16 µg/ml内具有良好的线性关系。伏立康唑最低定量限为0.03125 µg/ml。0.03125 µg/ml伏立康唑血浆样本经5次检测，准确度为（101.54±13.15）%，RSD为12.95%，信噪比S/N＞3，符合灵敏度要求。见图2。

图2 伏立康唑在空白血浆样本中的标准曲线图

2.3 提取回收率

伏立康唑及卡马西平提取回收率均＞92%，方法可行。见表1。

表1 提取回收率检测结果（，n=5，%）

表1 提取回收率检测结果（，n=5，%）

浓度（µg/ml） 伏立康唑 卡马西平8 95.53±9.70 94.14±6.59 2 92.53±6.45 92.13±4.71 0.5 93.33±5.37 93.72±8.33

2.4 准确度和精密度

各梯度浓度日内、日间RSD均＜10%，该方法准确度和精密度符合生物样本分析要求。见表2。

表2 测定伏立康唑血药浓度方法学的精密度和准确度（，n=5）

表2 测定伏立康唑血药浓度方法学的精密度和准确度（，n=5）

QC浓度（µg/ml）（µg/ml）RSD（%）日间浓度（µg/ml）RSD（%）日内浓度8 7.91±0.28 3.54 7.81±0.32 4.08 2 2.02±0.18 8.86 1.91±0.17 8.99 0.5 0.51±0.05 9.94 0.49±0.05 9.98

2.5 稳定性

3种不同稳定性条件下，伏立康唑检测结果稳定性较好，RSD均＜15%。见表3。

表3 不同条件下伏立康唑在血浆中的稳定性（，n=5）

表3 不同条件下伏立康唑在血浆中的稳定性（，n=5）

实验条件（%） 实测值 RSD（%）室温24 h 7.95±0.27 3.431.99±0.2311.460.51±0.0714.69冷冻3个月 7.83±0.182.291.92±0.178.81 0.47±0.0613.39冻融3次 7.78±0.33 4.261.86±0.2412.710.48±0.0611.95 8 µg/ml 2 µg/ml 0.5 µg/ml实测值 RSD（%） 实测值 RSD

2.6 实用性

2020年本院共检测230个伏立康唑样本，中位数为2.19（1.14～3.50）µg/ml。其中60.87%在1～5.5 µg/ml，21.74%低于目标值，17.39%高于目标值。选取其中有代表性意义的18个样本，制成散点图，分析本方法学的实用性。见图3。

图3 部分临床样本TDM结果

3 讨论

3.1 预处理方法的选择

有文献[11]采取3∶1（V/V）甲醇沉淀法处理血浆样本，该方法可使伏立康唑过度稀释，导致检测灵敏度下降。也有文献[12]采用2∶1（V/V）乙腈沉淀法，再用氮气吹干，少许流动相复溶，可解决伏立康唑过度稀释的问题。但研究中发现，氮气吹干后的沉渣中杂质太多，部分呈黏稠状，很难彻底吹干，加入流动相后，溶解不够充分，且内源性物质浓度同时被放大，影响检测结果。因此，本研究在采取乙腈沉淀蛋白法的基础上，用萃取液（乙酸乙酯/正己烷，4∶1，V/V）萃取，再用氮吹法将上层有机相吹干，加少量流动相复溶。通过乙腈沉淀法及萃取法，血浆样本中的蛋白沉淀较完全，内源性物质去除较彻底，对目标色谱峰干扰少，在一定程度上可降低柱压，降低色谱柱堵塞风险，起到保护色谱柱的作用。通过氮气吹干法及少量流动相复溶法，可使伏立康唑及卡马西平高度浓缩，伏立康唑最低定量限可达0.03125 µg/ml，检测灵敏度明显改善[11-12]。另一方面，血样预处理后，伏立康唑及卡马西平提取回收率较高，本方法学具优越性。

3.2 流动相的选择

HPLC法测定伏立康唑血药浓度多采用磷酸盐缓冲液[13-16]。在色谱分析系统中，常使用缓冲盐调节流动相pH值。但缓冲盐的过度使用会缩短色谱柱的使用寿命，特别是当缓冲盐析出时，可造成色谱柱堵塞，引起柱压升高、柱效下降，使保留时间不稳定或色谱峰形发生改变（裂峰、拖尾等）。缓冲液易滋生细菌，pH值易发生改变，常要求现配现用，也增加了工作量。本研究采用甲醇-水作为流动相，配制简单，可有效保护色谱系统。甲醇价格低廉且化学稳定性较好，使色谱条件更为稳定。研究中发现，当甲醇-水比例为57∶43（V/V），柱温为38 ℃，流速为1.1 ml/min时，可在缩短出峰时间的同时保证良好的分离度，有效提高检测效率。

3.3 内标物的选择

内标物应具有结构稳定、与目标物质不发生化学反应、与目标物质极性差异大等特点。本研究采用卡马西平作为内标物，可符合要求。研究表明，内标峰与样品峰分离度大于2。研究中发现，卡马西平内标溶液于4 ℃冰箱放置1年仍可保持较好的稳定性。

3.4 本方法用于治疗药物监测的意义

2020年本院共检测230个伏立康唑样本，只有60.87%的样本在目标范围内，进一步说明进行伏立康唑TDM的必要性。根据TDM结果，进行合理的用药建议，有效提高伏立康唑临床应用的有效性和安全性，进一步说明本方法学的实用性。

研究表明[17]，当伏立康唑未给予负荷剂量时，要在5～7 d后才能达到稳态血药浓度，当给予负荷剂量时，在3～5 d后可达到稳态血药浓度。有剂量调整时，应于调整后5 d复查血药浓度[18]。国内外多部指南均建议伏立康唑应给予负荷剂量，并进行TDM，在发生不良反应、治疗效果欠佳、序贯给药、停用或增加可能引起相互作用的药物时应再次进行TDM[19-20]。当伏立康唑低于1 µg/ml时，容易导致治疗失败；当浓度高于5.5 µg/ml不良反应发生率较高，包括肝毒性、视觉障碍、神经毒性、皮疹等[21-22]。因此，普遍认为1～5.5 mg/L是一个能最大化提高疗效，同时能明显减少不良反应的TDM浓度范围[23]。

TDM进一步证实正确采血时间的重要性。1号样本浓度为0.65 µg/ml。经分析，该患者在使用伏立康唑第2天就采血，此时因尚未达到稳态血药浓度，建议第4天复查，结果为2.27 µg/ml（2号样本）。3号样本浓度为0.72 µg/ml，采血时间为第3天再次给药前30 min。经分析，该患者未予负荷剂量，给药第3天未达到稳态血药浓度，建议第5天复查，结果为1.66 µg/ml（4号样本）。5号样本浓度为0.46 µg/ml，建议增加剂量，剂量调整后第2天复查，结果为0.79 µg/ml（6号样本）。经分析，该患者中途更改剂量，但剂量调整后第2天尚未达到稳态血药浓度，建议剂量调整后第5天复查，结果为 1.95 µg/ml（7 号样本）。

TDM可发现潜在的药物相互作用。8号样本浓度为7.89 µg/ml，经分析，该患者同时联用奥美拉唑，CYP2C19为超快代谢型。奥美拉唑可竞争性抑制CYP2C19代谢酶，使伏立康唑消除减慢[24]。降低剂量后，浓度恢复到3.32 µg/ml（9号样本）。10号样本浓度为0.61 µg/ml，经分析，该患者同时联用地塞米松。伏立康唑联用地塞米松时可使伏立康唑的清除率增加41.0%[25]。停用地塞米松后，浓度恢复到2.09 µg/ml（11号样本）。12号样本浓度为0.09 µg/ml，经分析，该患者为肺结核患者，但在伏立康唑给药前3 d已停用利福平。利福平为细胞色素P450酶强诱导剂，停药后其肝药酶诱导作用仍可持续7～10 d，甚至更长[26]。该患者停用利福平12 d后，重启伏立康唑药物治疗方案，最终测得浓度为1.91 µg/ml（13号样本）。

儿童伏立康唑血药浓度个体差异比成人更明显，影响因素更复杂，血药浓度与剂量相关性较小，一般需要比成人更大的剂量（按体重算）[27]。14号样本浓度为0.84 µg/ml，经分析，该患者为5岁男孩，体重18 kg，给药方案为100 mg，q12 h。根据说明书，伏立康唑用于2～12岁儿童，维持剂量8 mg/kg。最后调整给药方案为150 mg，q12 h，血药浓度升到1.88 µg/ml（15号样本），抗感染效果明显改善。通过伏立康唑TDM，可实现儿童患者的个体化给药。

TDM可发现潜在的药物不良反应。16号样本浓度为8.98 µg/ml，经分析，该患者入院时肝功能正常，用伏立康唑治疗后第5天谷丙转氨酶、谷草转氨酶均升高了3倍多，同时伏立康唑谷浓度为8.98 µg/ml。伏立康唑血药浓度≥4～6 µg/ml时，肝损伤的风险可增加4倍[28]。经综合考虑，建议医生停用伏立康唑，改用卡泊芬净，1周后转氨酶恢复正常。17号样本浓度为6.79µg/mL，同时患者出现低钾血症、视物模糊。经分析，该患者出现低钾血症可能与伏立康唑浓度过高有关[29]。降低伏立康唑剂量后，复查血药浓度为2.51 µg/ml（18号样本），同时该患者电解质紊乱得到纠正，视力恢复正常。

综上所述，伏立康唑体内药动学复杂，个体差异较大，药物相互作用较多，有必要进行TDM。本方法学灵敏度高、专属性强、准确度高、重现性好，满足开展TDM的基本要求。在方法学应用中，解决了很多临床实际问题，实现个体化给药。