赤霉素对鲜切莴苣酶促褐变及活性氧代谢的影响

刘云芬,田天容,殷菲胧,廖玲燕,普红梅,康超,帅良*

1(贺州学院 食品与生物工程学院/食品科学与工程技术研究院,广西 贺州,542899) 2(云南省农业科学院 农产品加工研究所,云南 昆明,650200)

莴苣(Lactucasativa)又称莴笋,是菊科一、二年生草本植物,富含丰富的蛋白质、维生素以及磷、钙、铁等矿物质,同时具有抗氧化、抗肿瘤等保健功能,鲜食口感爽脆,深受消费者的喜爱[1-2]。但是由于其含水量高,绿原酸、咖啡酸、类黄酮等多酚物质含量丰富[3],切割后容易引起组织代谢紊乱,发生黄化、褐变及腐烂变质,严重影响食用品质。

果蔬经切割处理后,发生显著的生理生化变化,机械伤害诱发活性氧爆发,破坏细胞组织正常代谢,诱导细胞膜脂过氧化,造成组织黄化、褐变[4-5]。鲜切果蔬褐变主要由酶促褐变造成,切割破坏了植物组织的细胞空间区域,使原本分布在叶绿体及其他色素体的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与分布在液泡内的酚类底物作用,氧化生成醌类物质,醌进一步在植物体内缩合或者与蛋白质反应,生成褐色或黑色物质[6-8]。减轻鲜切莴苣褐变有生物、物理、化学方法,主要包括气调包装[9]、紫外照射[10]、生物提取物[11-12]、涂膜[13]等处理。减少活性氧的积累,提高抗氧化酶活性,能有效减轻褐变的发生,也说明鲜切莴苣的褐变与活性氧代谢相关。

本研究中采用GA3处理鲜切莴苣,旨在选择合适的处理浓度,并探讨赤霉素对鲜切莴苣酶促褐变及活性氧代谢的影响,为赤霉素在鲜切果蔬中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莴苣购买于广西贺州泰兴超市;硫酸、盐酸、巯基乙醇,西陇科学股份有限公司;过氧化氢、磷酸氢二钠、无水乙醇、磷酸二氢钠、硫代巴比妥酸、硫酸钛、L-苯丙氨酸、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝(nitro-blue tetrazolium,NBT)、核黄素,广东省化学试剂工程技术研究开发中心;三氯乙酸、丙酮、氨水,天津市大茂化学试剂厂;赤霉素,生工生物工程有限公司,以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KDC-40低速离心机,安徽中佳科学仪器有限公司;DHG—9140A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;FA2004B电子天平,上海精科天美科学仪器有限公司;722 N可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;Centrifuge 5804R高速冷冻离心机,长沙湘锐离心机有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 处理方法

将莴苣洗净后,去除多余的水分,用不锈钢刀去皮切成厚度4 mm左右的圆片,挑选无病虫害、无空心的莴苣圆片随机分成4等份。配制GA3溶液,质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.4 g/L,将分好的莴苣薄片于各质量浓度中浸泡3 min。晾干后装入塑料托盘中,每个处理装15盒,每盘装10～12片,保鲜膜封装后放置8 ℃培养箱贮藏,于0、2、4、6 d分别取样测定生理生化指标,每个处理重复3次。

1.3.2 褐变度测定

参照帅良等[21]的方法。取5 g莴苣样品加入10 mL 80% (体积分数)乙醇研磨成均浆,在室温下避光反应30 min,每隔5 min 搅拌1次,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,收集上清液于420 nm处测定吸光度,以80%乙醇为空白,重复测定3次,结果以OD420表示。

1.3.3 总酚、类黄酮和醌含量测定

参考曹建康等[22]的方法。分别于280和325 nm处测定吸光值,以每 g鲜重在280 nm处的吸光值表示总酚含量,表示为OD280;每 g鲜重在325 nm处的吸光值表示类黄酮含量,即表示为OD325。

醌含量的测定参考ZHAN等[23]的方法,略有改动。

1.3.4 丙二醛含量测定

参考刘瑾等[24]的方法,略有改动。MDA含量计算公式为:

MDA含量/(μmol·g-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(1)

1.3.5 H2O2含量测定

参考LIN等[4]的方法,略有改动。用标准H2O2溶液制作标准曲线,计算样品中H2O2的含量(μmol/g)。

1.3.6 过氧化氢酶(catalase,CAT)活性测定

参考LIN等[4]的方法,略有改动。3 mL的反应体系包括2.8 mL 15 mmol/L H2O2(0.05 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液配制),0.2 mL的酶液,测定1 min内OD240的变化,以1 min下降0.01为1个酶活单位,用U/(min·g)表示。

1.3.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定

参照袁芳等[5]的方法,略有改动。3 mL的反应体系包括2 mL 0.2 mol/L pH 7.8磷酸缓冲液(含0.1 mol/L EDTA),0.3 mL 220 mmol/L甲硫氨酸,0.3 mL 1.25 mmol/L NBT,0.3 mL 0.033 mmol/L核黄素,0.1 mL粗酶液。混合物光下反应20 min,560 nm处测定吸光值。1个酶活单位定义为抑制NBT光还原率50%的酶量,以U/(min·g)表示。

1.3.8 过氧化物酶(polyphenol oxidase,POD)活性测定

参考KHADEMI等[25]的方法,略有修改。3 mL反应液包括0.2% (体积分数)愈创木酚1.9 mL,0.1% (体积分数) H2O21 mL,粗酶液0.1 mL,在470 nm处测定吸光值,以1 min增加0.01为1个酶活性单位(U),用U/(min·g)表示,每个处理重复3次。

1.3.9 多酚氧化酶活性测定

参考ZHAN等[23]的方法,略有改动。3 mL的反应液中含2.8 mL 0.2 mol/L邻苯二酚(磷酸缓冲液配制),0.2 mL粗酶液,在398 nm下测定2 min内的吸光值,以1 min增加0.01为1个酶活力单位(U),酶活性以U/(min·g)表示,重复3次,以缓冲液为空白对照。

1.3.10 苯丙氨酸解氨酶活性测定

参照LUO等[19]的方法。取0.5 mL粗酶液,2.5 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸(37 ℃预热15 min),混匀后反应液在37 ℃水浴保温1 h,加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液终止反应,测定290 nm处的吸光值。以反应时间零为参比。以A290变化0.01为1个酶活单位(U),用U/(h·g)表示。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS v18.0软件进行数据处理和统计分析,数值以3次数据平均值±标准误差表示,差异显著性检验采用Duncan法(P<0.05),使用SPSS v18.0结合Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度GA3处理对鲜切莴苣褐变度的影响

鲜切果蔬褐变主要原因是酚类物质发生氧化反应,导致大量颜色物质积累,严重影响了鲜切果蔬的感官品质[6],因此褐变度是反映鲜切果蔬品质的重要指标。结果如图1所示,随着贮藏时间的延长,鲜切莴苣的褐变度逐渐增加。与CK相比,GA3降低了整个贮藏期的褐变度,尤其是4 d以后,褐变度显著低于CK(P<0.05),表明GA3处理能有效抑制鲜切莴苣的褐变。刘瑾等[24]的研究也表明,赤霉素处理显著降低贮藏期间李果实的褐变指数。本研究中,0.2 g/L处理后褐变度较0.1、0.4 g/L低,因此在后续的研究中选取0.2 g/L为试验质量浓度。

图1 不同浓度GA3处理对鲜切莴苣褐变度的影响Fig.1 Effects of GA3treatment at different concentrations on browning degree of fresh-cut lettuce

2.2 GA3处理对鲜切莴苣总酚、类黄酮和醌含量的影响

植物体内存在着大量酚类物质,这些酚类物质也是重要的次级代谢物,一方面它具有一定的抗氧化能力,可以修复自身伤害,另一方面作为酶促褐变反应的底物,参与酶促褐变反应[26]。图2所示为各处理对鲜切莴苣总酚、类黄酮及醌含量的影响。

a-总酚含量;b-类黄酮含量;c-醌含量图2 GA3处理对鲜切莴苣总酚、类黄酮和醌含量的影响Fig.2 Effects of GA3 treatment on total phenol,flavonoid content and quinone content of fresh-cut lettuce

如图所示,CK的总酚、类黄酮、醌含量变化趋势一致,均随贮藏时间的延长,逐渐升高;而GA3处理后总酚和类黄酮含量呈上升趋势,但醌含量增长趋势较为缓慢,且GA3处理在整个贮藏期间,总酚、类黄酮和醌含量显著低于CK(P<0.05)。综上结果表明,GA3处理能有效减轻鲜切莴苣贮藏期间酚类物质积累,这与蔡葛平[27]的研究结果一致。

2.3 GA3处理对鲜切莴苣MDA和H2O2含量的影响

MDA和H2O2是细胞膜脂过氧化的重要产物,它的含量反映细胞膜受氧化损伤的程度[28]。过量积累MDA和H2O2破坏了细胞膜组分,导致褐变的发生[4]。如图3-a所示,随着贮藏时间的延长,CK 中MDA含量在前4 d逐渐增加,此后急剧上升;而GA3处理含量在前4 d增幅较小,4 d以后MDA含量显著低于CK,第6天时MDA含量较CK低约50%。

GA3处理对鲜切莴苣H2O2含量的影响如图3-b所示。随着贮藏时间延长,各处理鲜切莴苣H2O2含量呈现先下降再升高的趋势。GA3处理后的鲜切莴苣H2O2含量明显低于CK,尤其是在4、6 d时,GA3处理后的H2O2含量较CK低69.7%、70.2%。与曾凯芳等[18]、LUO等[19]的研究结果一致,因此,0.2 g/L的GA3处理能显著降低MDA和H2O2含量,减少膜脂氧化损伤,从而减轻褐变。

a-MDA含量;b-H2O2含量图3 GA3处理对鲜切莴苣MDA和 H2O2含量的影响Fig.3 Effects of GA3 treatment on MDA and H2O2content of fresh-cut lettuce

2.4 GA3处理对鲜切莴苣SOD和CAT活性的影响

SOD和CAT是植物抗氧化防御系统中重要的2个抗氧化酶,SOD将·O2-转化成H2O2,而CAT将H2O2分解成水和氧气,从而减轻活性氧损伤[25]。如图4-a所示,各处理SOD活性先上升,随后活性出现不同程度的下降,GA3处理SOD活性低于CK,尤其在贮藏后期,显著低于CK。与此类似,采前喷施GA3,显著降低桃果实的SOD活性[29]。

图4-b显示随着贮藏时间的延长,CAT活性呈现先下降后上升的趋势,在2 d 时活性最低,GA3处理在整个贮藏期间CAT活性都高于CK。综上结果表明,GA3处理增强了鲜切莴苣贮藏期间CAT活性,降低了SOD活性,从而促进了H2O2的分解,减少了氧化损伤。

2.5 GA3处理对鲜切莴苣POD、PPO和PAL活性的影响

PPO和POD是苯丙烷代谢途径中的2个末端氧化酶,能将酚类物质氧化成褐色物质[29]。对于POD活性,如图5-a所示,GA3处理与CK交互变化,在贮藏前期,GA3处理的POD活性高于CK;在贮藏中后期,CK的POD活性呈上升趋势,显著高于GA3处理,而GA3处理的活性在4 d后下降趋势较平缓。POD在植物中有双重作用,既可以作为抗氧化酶清除H2O2,减少活性氧积累,又能催化酚类物质氧化,引起褐变。GA3处理前期POD活性升高可能主要用于分解H2O2,从而引起2 d时H2O2含量较低(图3-b)。

a-SOD活性;b-CAT活性图4 GA3处理对鲜切莴苣SOD和CAT活性的影响Fig.4 Effects of GA3 treatment on CAT and SOD activity of fresh-cut lettuce

由图5-b可知,CK的PPO活性在整个贮藏期间一直呈上升趋势,而GA3处理的PPO活性呈波动变化,但CK始终高于GA3处理,尤其是在储藏第4 天,CK比GA3处理高32.89%。PPO和POD活性的变化情况表明GA3处理减轻了鲜切莴苣褐变程度。

a-POD活性;b-PPO活性;c-PAL活性图5 GA3处理对鲜切莴苣POD、PPO和PAL 活性的影响Fig.5 Effects of GA3 treatment on POD,PPO and PAL activity of fresh-cut lettuce

由图5-c可知,随着贮藏时间的延长,PAL活性呈现先上升后下降的趋势;除了第4 天外,其他时间CK的PAL活性均高于GA3处理。PAL是苯丙烷代谢途径上的关键酶[29],主要负责酚类物质的生物合成。本研究表明GA3处理能有效抑制PAL活性,减少酚类物质的产生。PAL、PPO和POD是鲜切果蔬酶促褐变过程中重要的酶,抑制这些酶的作用,能有效抑制褐变的发生[6,23]。综上结果表明,GA3处理能有效抑制PAL、PPO和POD活性,从而抑制鲜切莴苣发生酶促褐变,这些结果与酚类物质的变化趋势一致。

3 结论

本研究采用不同浓度的GA3处理鲜切莴苣,发现0.2 g/L的GA3能显著降低莴苣的褐变度,维持鲜切莴苣的品质。0.2 g/L GA3显著抑制了鲜切莴苣贮藏期间MDA、H2O2含量的增加,抑制了酚类物质、类黄酮以及醌类物质等色素的积累,抑制了PAL、PPO、POD和SOD活性,提高了CAT活性,减轻了活性氧的积累,从而延缓鲜切莴苣的褐变,保证了鲜切果蔬贮藏期间的品质。